4.2.1. Использование метода тонкослойной хроматографии для разделения углеводов
Метод ТСХ позволяет быстро и эффективно разделить и количественно анализировать сахара даже при малом их содержании.
Разделение происходит в 2 этапа – в зависимости от применяемой системы растворителей. Вначале при поднятии фронта на 9 см используют одну систему растворителей, затем – другую, поскольку при l ≥ 15 см моносахара разде-ляются на глюкозу и фруктозу (см. рис. 4.7).
Рис. 4.7. Схема разделения простых сахаров
Рис. 4.8. Последовательность проявления разделенных сахаров на пластине:
1 – рафиноза; 2 – малибиоза; 3 – мальтоза; 4 – сахароза;
5 – глюкоза; 6 – фруктоза; 7 – ксилоза
Системы растворителей здесь не называются; для каждого, отдельно взято-го, случая они табулированы. Пятна разделенных сахаров имеют характерную темно-синюю окраску.
Последовательность проявления пятен продуктов разделения представлена на рис. 4.8.
Наиболее эффективно разделение сахаров происходит в тонком (δ = 0,1– 0,2 мм) слое бумажной целлюлозы, нанесенной на стеклянные пластины.
Однако следует учитывать, что процесс движения восходящего потока рас-творителей занимает не менее 5–10 ч (требует временных затрат).
Количественное определение проводят по методу сравнения площади пят-на и интенсивности его окраски с таковыми для стандартных растворов (метод «свидетелей»).
4.2.2. Анализ пестицидов и ядохимикатов в растительном сырье
Методика определения фосфорорганических пестицидов в воде (жидкостях) методом ТСХ
Разделение пестицидов происходит в тонком слое силикагеля с различ-ными подвижными растворителями – гексаном, ацетоном, хлороформом.
Обнаружение зон локализации фосфорорганических соединений на хрома-тограммах осуществляют с помощью следующих реагентов: бромфенолового синего, нитробензилпиридина и др.
Предел обнаружения исследуемых пестицидов (антио, афугана, метафоса, карбофоса, валексона, фозалона и др.) составляет 0,2–0,5 мкг. Мешают опреде-лению соединения, содержащие серу.
Количественная оценка при анализе методом ТСХ с различными условиями проявления проводится путем сравнения площадей пятен пробы и стандартов на одной пластинке.
Методика сводится к следующему.
1. Последовательно проводят экстракцию из анализируемой пробы той или иной группы пестицидов путем обработки ее гексаном либо хлороформом, а затем экстракт очищают.
2. Упаренную (до 0,3 мл) пробу микропипеткой количественно переносят на хроматографическую пластинку. Также наносят различные количества (0,05; 0,10; 0,15 мл) стандартного раствора, и помещают пластину в камеру с органи-ческим растворителем.
3. После подъема фронта растворителя на 10 см пластинку вынимают, высушивают и опрыскивают проявляющим агентом – раствором AgNO3 (или PdCl2).
Под действием источника УФ света (лампы ПРК) через 10–15 мин на хроматограмме проявляются пестициды в виде пятен определенного цвета – се-рого, желто-коричневого либо лилового (цвет зависит от вида проявителя). При необходимости осветляют фон пластины с помощью 2%-го раствора лимонной кислоты.
Величины Rf пестицидов при различных системах растворителей известны и сведены в специальные таблицы.
Количественное определение проводят путем сравнения площади пятен пробы и стандартов.
Содержание пестицида в пробе (X, мг/мл) рассчитывают:
,
(4.17)
где А – содержание препарата в стандарте с наиболее близкой к пробе пло-щадью пятна, мкг;
S1 – площадь пятна стандарта, мм2;
S2 – площадь пятна пробы, мм2;
p – объем пробы для анализа, мл.
Метод ТСХ успешно применяют также для количественного обнаружения и определения некоторых пестицидов (антио, фосфамида) в меде – с пределом измерения 0,1 мг/кг. Метод практически аналогичен представленному выше и основан на извлечении антио и фосфамида из меда гексаном, очистке экстрак-тов от восков и пигментов и последующем хроматографировании в тонком слое силикагеля, закрепленного гипсом.
Подвижная фаза – смесь ацетона и гексана в соотношении 1:2.
Для обнаружения зон локализации пестицидов используют смесь ацето-новых растворов бромфенолового синего и AgNO3 с последующей обработкой лимонной кислотой.