4.1.2. Использование гжх для анализа жирорастворимых витаминов в составе масел (жиров)

Метод ГЖХ используется для определения жирорастворимых витаминов – изомерных форм токоферолов (α-, β-, γ-), которые разделяются в виде три-метилсилильных производных (ТМС-эфиров).

Цель такой обработки заключается в снижении сорбционной способности токоферолов путем изоляции ОН-групп на поверхности носителя (целит-545), способных к контакту с реакционноспособными спиртовыми группами токофе-ролов:

│ │ │ │

– Si – O – Si – + Si₂(CH₃)₆HN₂ → – Si – O – Si – + HN₃ ↑. (4.12)

│ │ │ │

HO OH (CH₃)₃SiO OSi(CH₃)₃

При этом дополнительно удаляются и загрязнения с поверхности носителя.

Метод исследования заключается в следующем.

1. Вначале выделяют неомыляемую фракцию из масла путем обработки его спиртовым раствором КОН, экстракции метиловым эфиром и очистки от каротиноидов в колонке с диатомитом;

2. Переводят концентрат токоферолов в ТМС-эфиры;

3. Разделяют токоферолы на хроматографе (неподвижная фаза 10%-й сили-коновый эластомер на целите-545).

Качественную идентификацию проводят по сопоставлении времени удер-живания (τ_R) пиков ТМС-эфиров для каждого изомера токоферолов с временем удерживания внутреннего стандарта (в качестве последнего выступают соевое масло, содержащее α-, β-, γ-токоферолы).

Отношения времен удерживания различных соединений в составе расти-тельного масла и внутренних стандартов сведены в специальные таблицы.

Согласно методу внутреннего стандарта, количественный анализ токофе-ролов (X_i, %) в растительном масле проводят согласно выражению:

, (4.13)

где S_i – площадь пика ТМС – эфира изомера токоферола;

∑ S_i – сумма площадей всех пиков ТМС-эфиров на хроматограмме, при этом

S_i = h_i · b_1/2 · κ , (4.14)

где – полуширина пика;

κ – поправочный коэффициент; при этом.

, (4.15)

где P_вит и P_ст – навески одного из изомеров и стандарта;

S_ст и S_вит – соответствующие площади пиков на хроматограмме.

4.2. Тонкослойная хроматография

Метод тонкослойной хроматографии (ТСХ), получивший широкое распро-странение, был разработан Н.А. Измайловым и М.С. Шрайбер в 1938 г.

Основной характеристикой в ТСХ является подвижность:

, (4.16)

где х₁ – расстояние от стартовой линии до центра пятна анализируемого компо-нента;

х_f – расстояние, пройденное растворителем за время опыта.

Качественный анализ основан на сопоставлении опытных значений R_f с известными (табличными) значениями подвижности для вещества, полученны-ми при соблюдении фиксированных стандартных условий.

Перспективным приемом для анализа пищевых продуктов является сочета-ние методов ТСХ и ГЖХ, когда выходящая из колонки газовая смесь перено-сится на пластинку ТСХ и анализируется. При этом не только накапливается необходимая информация о составляющих продукта, но и решается вопрос о его химических превращениях в ходе эксперимента.

Рис. 4.5. Образование пятна анализируемого образца в методе ТСХ

○

Рис. 4.6. Определение количества анализируемого вещества по его известной концентрации в центре пятна

Проведение анализа включает следующие процедуры.

На расстоянии 0,5–1,5 см от края пластины, на которую нанесен тонкий слой сорбента (Al₂O₃, SiO₂ и др.), размечают так называемую «стартовую» линию. На нее с помощью микрошприца наносят пробу анализируемого ве-щества в одну точку и пробы стандарта с известной концентрацией того же вещества. Край пластины погружают в стеклянную хроматографическую каме-ру прямоугольного сечения, заполненную растворителем. При движении фрон-та растворителя вдоль пластины за время τ проба анализируемого вещества перемещается на определенное расстояние, которое будет определяться сорб-ционным сродством вещества к материалу, нанесенному на пластину. Анализи-руемое вещество образует пятно определенного размера, учитываемого в по-следующих расчетах (см. рис. 4.5).

Количественный анализ может быть проведен двумя путями:

1. На пластинке.

Берут мелкоразмеченную кальку (или миллиметровку), определяют с ее помощью площадь пятна (S_п) и по градуировочному графику, построенному в координатах С – S_п, находят содержание анализируемого вещества.

Используют специальные приборы – спектроденситометры, позволяющие определить оптическую плотность в центре пятна (D_ц).

Затем по предварительно построенным градуировочным графикам в коор-динатах «стандартная концентрация анализируемого элемента – оптическая плотность в центре пятна» определяют количество анализируемого вещества (С_х), как это показано на рис. 4.6.

Часто денситометрическое количественное определение используют в ме-тоде бумажной распределительной хроматографии.

2. Удаление вещества с пластины.

Вещество механическим путем удаляют после хроматографического разде-ления с пластины и анализируют спектрофотометрически. Содержание компо-нента в смеси определяют по градуировочному графику, построенному в коор-динатах С – D, либо весовым методом.