Состав некоторых реактивов, используемых в иммунологических исследованиях

1. Растворы для окраски популяций лейкоцитов

Краска Задорожного-Дозморова.

Краска Задорожного-Дозморова состоит из 0,01% раствора красителя азура-II, приготовленного на 0,05% растворе детергента тритона Х-100. Азур-II – это смесь азура-I и метиленового синего в соотношении 1:1. Перед употреблением краску необходимо выдержать не менее 1 недели.

Краска Романовского-Гимза

Краска Романовского–Гимза включает в себя 3 г азура-2, 0,8 г эозина В, 250 г глицерина и 250 г метилового спирта. Перед использованием краску разводят дистиллированной водой в соотношении 1:10.

2. Среда для хранения форменных элементов крови.

Раствор Хенкса

На 1 л раствора Хенкса необходимо: NaCl – 8,0 г, KCl – 0,4 г,MgSO₄⋅10H₂O – 0,2 г, CaCl₂⋅6H₂O – 0,276 г, KH₂PO₄ – 0,06 г, Na₂HPO₄⋅12H₂O – 0,153 г, глюкоза – 1,0 г, феноловый красный – 0,02 г. Навески реактивов растворяют в 1 л дистиллированной воды, рН раствора доводят до величины 7,2-7,4 1%-ным раствором NaOH.

Физиологический раствор 0,9 %-ный, рН 7,0-7,2

На 1 л раствора необходимо: 9,0 г химически чистого NaCl, растворить его в небольшом количестве дистиллированной воды и довести объем до 1 л дистиллированной водой; измерить рН полученного раствора на ионометре. Доведение рН до нужных показателей проводится 1М НСl или NaOH. Хранится физраствор при комнатной температуре.

Забуференный физиологический раствор

На 1 л раствора необходимо: 8,2 г NaCl, Na₂HPO₄⋅12H₂O – 1,15 г, KH₂PO₄ – 0,2 г; довести до 1 л дистиллированной водой; измерить рН на ионометре (должно быть рН 7,2-7,4); хранить при комнатной температуре.

Теоретическая справка

Лейкограмма периферической крови человека

Лейкоциты – весьма неоднородная по составу совокупность клеток, которые отличаются друг от друга по своему происхождению, морфологическим (величина клеток, строение ядра, наличие гранул с физиологически активными веществами в цитоплазме), цитохимическим и функциональным свойствам.

Лейкоциты делят на два основных типа, один из которых характеризуется зернистой цитоплазмой (гранулоциты), другой – незернистой (агранулоциты).

Существует три типа зернистных лейкоцитов, различающихся окраской цитоплазматических гранул.

Нейтрофилы – это лейкоциты, диаметром 10-15 мкм, гранулы которых при нейтральных значениях рН 7,0 не воспринимают ни основные, ни кислые красители. Они отличаются формами ядер, а не гранул, поэтому их часто называют полиморфно-ядерными лейкоцитами. По этим качествам нейтрофилы разделяются на юные, палочкоядерные и сегментированные. Юные и палочкоядерные клетки являются незрелыми формами нейтрофилов. Цитоплазма нейтрофилов бледно-розовая с обильной, неравномерной и мелкой зернистостью, окрашенной в розовато-синий или фиолетовый цвет. Ядро темно-фиолетовое палочковидное, либо сегментированное (2–5 сегментов).

Нейтрофилы – самая многочисленная группа лейкоцитов периферической крови. Они составляют 48-78% от общего числа лейкоцитов.

Основная эффекторная функция нейтрофилов – это фагоцитоз, который они могут осуществлять только один раз, после чего погибают. Они не обладают специфичностью и способны уничтожать бактерии, клетки крови, продукты распада тканей, неорганические частицы. В комплексе с антителами и системой комплемента они выполняют важную роль в развитии острой защитной (воспалительной) реакции на инфекцию.

Нейтрофилы содержат гранулы двух типов. Первичные гранулы представляют собой лизосомы и содержат лизоцим, кислые гидролазы и миелопероксидазу. Вторичные гранулы называют специфическими. Помимо лизоцима они содержат лактоферрин и антибиотические белки, разрушающие клетки микроорганизмов (дефензины, сепроцидины, кателицидины, белок, способствующий повышению проницаемости клеточной стенки бактерий).

Эозинофилы – округлые клетки, диаметром 12-17 мкм, содержат около 200 крупных специфических гранул, которые интенсивно окрашиваются кислым красителем эозином. Цитоплазма этих лейкоцитов окрашена в слабо-голубой цвет, но плохо заметна из-за обильной желто-красной зернистости. Ядро рыхлое, широкое, состоит из 2-3 сегментов, окрашено в фиолетовый цвет.

Эозинофилы составляют 1-4 % всех лейкоцитов.

Это – специализированная популяция лейкоцитов, способных поражать крупные внеклеточные паразиты (например, шистосомы), которые не поддаются фагоцитозу. Токсикогенность эозинофилов обусловлена реакцией дегрануляции: многочисленные гранулы, содержащие токсические вещества, сливаются с цитоплазматической мембраной и их содержимое высвобождается во внеклеточную среду. Кроме того, эозинофилы образуют токсичные реакционноспособные метаболиты кислорода. Оба механизма составляют основу противогельминтного иммунитета.

На поверхности эозинофилов имеются рецепторы к IgЕ, поэтому они участвуют в реакциях антиген-антитело и могут повреждать не только чужеродные, но и клетки своего организма при аллергических процессах.

Количество эозинофилов увеличивается при иммунизации, воспалительных и аллергических реакциях, аутоиммунных заболеваниях.

Базофилы – это лейкоциты, гранулы которых окрашиваются основными красителями. Форма клетки округлая или округло-овальная, диаметр клетки – 8-12 мкм. Цитоплазма окрашена в слабо-розовый цвет (более интенсивный, чем у нейтрофилов) с крупными гранулами темно-фиолетового цвета. Ядро округлое или неясной структуры с 2-3 лопастями, окрашено в фиолетово-розовый цвет.

Базофилы присутствуют в иркулирующей крови в очень небольших количествах (всего 0,2–0,5 % от общего числа лейкоцитов).

Клетки базофилов заполнены гранулами, в которых содержатся различные медиаторы и биологически активные вещества (гистамин, гепарин, фосфохолинэстераза А). При активации базофилов аллергенами медиаторы высвобождаются, повреждают микроорганизмы и собственные окружающие клетки, способствуют развитию анафилактической реакции, усиливают воспалительный процесс.

Среди агранулоцитов существует два вида лейкоцитов. и мелкие называются лимфоцитами, так как они обнаруживаются не только в крови, но и в лимфе, и более крупные и не столь многочисленные – моноциты.

Лимфоциты (21–35 % всех лейкоцитов) – округлые клетки (диаметр – 5-15 мкм) с крупным, окрашенным в темно-фиолетовый цвет ядром и узким ободком ярко-голубой или синей цитоплазмы, либо клетки с более бледным ядром, часто бобовидной формы, и широким ободком серовато синей цитоплазмы с единичными азуровыми включениями.

Сведения об особенностях структуры и иммунологических функция отдельных популяций и субпопуляций лимфоцитов приведены в разделах 3 и 4 настоящего пособия.

Моноциты – более крупные клетки (12-20 мкм), ядро светлофиолетового или сиреневого цвета, в виде боба, бабочки или гриба, занимает большую часть клетки. Протоплазма синевато-дымчатая, иногда содержащая в большом количестве мелкую азурофильную зернистость. Моноциты в норме составляют 2-8% от общего количества лейкоцитов.

Электронно-микроскопические исследования выявили особенности ультраструктуры моноцитов: складчатость наружной мембраны, развиты комплекс Гольджи и большое количество лизосом в цитоплазме. Лизосомы содержат несколько типов кислых гидролаз, пероксидазу, разлагающую пероксид водорода. Все эти ферменты необходимы для внутриклеточного разрушения микроорганизмов.

Из крови моноциты мигрируют в ткани, где превращаются в тканевые макрофаги.

Количественный состав отдельных видов лейкоцитов периферической крови характеризует функциональное состояние кроветворной системы. Изменения в нем могут быть обусловлены заболеваниями системы крови и реакцией кроветворного аппарата на развитие самых разнообразных патологических состояний.

занятие №2

ФАГОЦИТОЗ. контактный киллинг

Изучение активности клеточных механизмов врожденного иммунитета

Вопросы для подготовки

1.  Врожденный иммунитет, определение, эффекторы, механизмы и функции.

2. Патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (PAMP) и патоген-распознающие рецепторы (PRR), определение понятия, примеры. Классификация PRR.

3. Toll-like рецепторы, история открытия и классификация. Трансдукция сигнала.

4. Хемотаксис. Роль молекул адгезии и хемокинов в миграции лейкоцитов из кровяного русла в очаг воспаления. Воспаление как защитная реакция организма, стадии.

5. Фагоцитоз, определение понятия, роль фагоцитоза в иммунной защите.

6. Общая характеристика фагоцитирующих клеток их функциональные отличия. Распознавание клетками объектов фагоцитоза. Опсонизация и рецепторы фагоцитов.

7. Общая характеристика стадий фагоцитоза. Механизмы завершенного и незавершенного фагоцитоза.

8. Участие цитоскелета в поглощении фагоцитируемых объектов.

9. Бактерицидные системы фагоцитов.

10. NK-клетки, рецепторы и функции.

11. Механизм контактного киллинга.

12. Заполнить таблицу «Роль показателей естественной резистентности в антимикробной защите организма человека»:

Фактор	Роль в антимикробной защите	Факторы естественной резистентности (для внесения в незаполненный столбец таблицы)
	Секреция цитокинов, регулирующих клеточные и гуморальные механизмы защиты	Нейтрофилы Естественные киллеры (NK-клетки) Белки системы комплемента Белки острой фазы воспаления (БОФ) Лизоцим Дефенсины Макрофаги Дендритные клетки Тромбоцитарный катионный белок (ТКБ)
	Фагоцитоз внеклеточных патогенов
	Лизис клеточной стенки преимущественно грам+ бактерий
	Опсонины (факторы, усиливающие фагоцитоз)
	Уничтожение клеток, инфицированных микроорганизмами, опухолевых клеток
	Лизис преимущественно грам- бактерий и усиление цитолиза инфицированных, опухолевых клеток
	Универсальные антимикробным факторы (широкий спектр антимикробного действия)

9. Заполнить таблицу «Неспецифическое распознавание патогенов»:

PAMP*	PRR*	PAMP	PRR
Пептидогликан		Порины, белки клеточной стенки, белки ресничек
Тейхоевые и липотейхоевые кислоты
Несиалированные полисахариды		Белки вирусных капсидов
Липополисахариды		Гликопротеины суперкапсидов
Липоарабиноманнаны, миколовые кислоты		Неметилированные СрG-ДНК
Флаггеллин		Двунитевые РНК

* PAMP – патоген-ассоциированные молекулярные паттерны и PRR – патоген-распознающие рецепторы