- •А.А.Чиркин
- •Министерство образования Республики Беларусь
- •Основы биотехнологии
- •Теоретическое содержание курса
- •Практикум
- •Работа 3. Разделение аминокислот методом тонкослойной ионообменной хроматографии (уирс).
- •Работа 4. Определение концентрации общего белка в сыворотке (плазме) крови биуретовым методом (набор нтк «Анализ-х») - уирс
- •Работа 5. Колоночная гель-фильтрация.
- •Работа 6. Определение термолабильности амилазы слюны.
- •Вариант 2
- •Работа 7. Определение оптимума рН для действия амилазы.
- •Работа 8. Влияние активаторов и ингибиторов на активность амилазы.
- •Работа 9. Специфичность действия ферментов
- •Работа 10. Исследование свойств тирозиназы из картофеля.
- •Работа 11. Ингибирующее действие хлорид-ионов на дегидрогеназный комплекс картофеля.
- •Работа 12. Определение активности амилазы крови с помощью метода «сухой химии» в сочетании с рефлометрией.
- •Работа 13. Определение активности щелочной и кислой фосфатаз в сыворотке крови по гидролизу -глицерофосфата (метод Боданского), уирс.
- •Работа 14. Качественные реакции на витамин а.
- •Работа 15. Количественное определение витамина а в рыбьем жире.
- •Работа 16. Качественные реакции на витамин д.
- •Работа 17. Обнаружение эргостерола в дрожжах.
- •Работа 18. Качественная реакция на викасол.
- •Работа 107. Качественная реакция на витамин е с азотной кислотой.
- •Работа 19. Количественное определение витамина е.
- •Работа 20. Количественное определение витамина с в хвое, шиповнике, картофеле, луке, молоке, капусте по методу Тильманса.
- •Работа 21. Разделение модельной смеси водорастворимых витаминов методом тонкослойной хроматографии.
- •Работа 22. Выделение фолиевой кислоты из дрожжей и ее обнаружение.
- •Вопросы итогового контроля (зачет)
Работа 5. Колоночная гель-фильтрация.
Для гель-фильтрации используются так называемые молекулярные сита - инертные гидратированные полисахаридные материалы, представляющие собой пористые гранулы. Их получают на основе декстрана (сефадексы - бактериальный полисахарид), агарозы (из некоторых морских водорослей) или полимеризованных акриламидных гелей (акрилекс).
Принцип метода. Разделительный гель состоит из гранул с определенным размером пор и межгранульного пространства. Молекулы, размер которых превышает размер пор гранул, движутся только в пространстве между гранулами и первыми выходят из колонки. Молекулы, размеры которых меньше размера пор, диффундируют в гранулы и обратно, поэтому их вымывание (элюирование) из колонки замедляется. Чем меньше молекулярная масса вещества, тем требуется больший объем элюирующей жидкости для вымывания его из колонки.
Реактивы, исследуемый материал
1. Раствор хлористого натрия, 8.5 г/л. 2. Гель сефадекса G-200 или 100 (или акрилексы соответствующих марок). 3. Смесь растворов: ненасыщенного раствора голубого декстрана, раствора гемоглобина 200 г/л, насыщенного раствора рибофлавина (1:1:1).
Ход работы
Колонку для разделения веществ заполнить гелем, полученным при гидратировании сефадекса G-200 изотоническим раствором хлористого натрия. Над гелем всегда должен находиться слой изотонического раствора хлористого натрия, чтобы гель не высыхал. На поверхность геля нанести 2-3 капли раствора, представляющего собой смесь трех веществ: голубого декстрана (М.М. 107), рибофлавина (М.М. 3102) и гемоглобина (М.М. 64,6103). Раствор для фракционирования должен сначала впитаться гелем, затем в колонку внести 2 раза по 2 мл изотонического раствора хлористого натрия. После этого подключить капельницу с изотоническим раствором хлористого натрия, предназначенным для элюирования разделяемых веществ. При разделении смеси для гель-фильтрации необходимо следить, чтобы в колонке был ток жидкости (т.е. открыт зажим снизу). По мере прохождения через колонку элюирующего раствора смесь разделяется на фракции, окрашенные в различные цвета. Каждую фракцию собрать в отдельную пробирку. В соответствии с относительной молекулярной массой быстрее всего элюируется декстран (голубой), а затем гемоглобин (красный) и рибофлавин (желтый). После элюирования смеси колонку необходимо промыть изотоническим раствором хлористого натрия до тех пор, пока гель станет бесцветным, затем закрыть и оставить небольшой слой раствора над гелем. Только в таком состоянии колонку можно использовать для работы повторно.
Работа 6. Определение термолабильности амилазы слюны.
Вариант 1
Реагенты |
Опыт 1 |
Опыт 2 |
Контроль |
|
Слюна 1:10, кап. |
10 |
- |
- |
|
Кипяченая слюна, кап. (кипятить 2 мл разведенной слюны 5-8 мин, охладить) |
- |
10 |
- |
|
Н2О, кап. |
- |
- |
10 |
|
Крахмал 1%, кап. |
10 |
10 |
10 |
|
|
Термостат |
38 С 10 минут |
|
|
Реакция с йодом (5 кап. Раствора из пробирки + 1 кап. I2 в KI), окраска |
|
|
|
|
Реакция Троммера (5 кап. Раствора из пробирки+5 кап. 10% NaOH+3 кап. 1% CuSO4, кипятить 1 мин.), окраска |
|
|
|
|
Вывод |
|
|
|
|