Работа 3. Разделение аминокислот методом тонкослойной ионообменной хроматографии (уирс).

Принцип метода. Разделение аминокислот из их смеси производят на катионообменной синтетической смоле типа дауэкс 50х8. Удобно пользоваться готовыми пластинками типа «Фиксион 50х8», на которых нанесен сильный катионит в натриевой форме. При нанесении образца на пластинку все аминокислоты должны сорбироваться в стартовой позиции путем их обмена с катионом натрия. Следовательно, все аминокислоты в исходной пробе должны быть в форме катионов, что достигается доведением наносимого раствора до рН ниже 2,2. Удержание аминокислот смолой зависит от степени диссоциации основных и кислотных групп аминокислоты (т.е. от величины их рК), от числа этих групп в молекуле, от способности к гидрофобным взаимодействиям со смолой и некоторых других условий. Ароматические и основные аминокислоты (арг, гис, лиз, фен, тир), а также лейцин прочно удерживаются на катионите. Для их разделения применяют пропускание через слой смолы цитратного буфера рН 5,25 с концентрацией Na⁺ 0,35 М. В этих условиях все остальные аминокислоты (кислые и нейтральные) приобретают высокую подвижность и идут с фронтом растворителя. Для выявления отдельных аминокислот пластинку опрыскивают раствором нингидрина. Появляются фиолетовые пятна аминокислот, располагающиеся по длине пластинки в последовательности по степени возрастания подвижности аминокислот. Полуколичественная оценка содержания аминокислоты в смеси достигается путем сравнения величины пятна из анализируемого образца с пятном соответствующей стандартной аминокислоты.

Реактивы, исследуемый материал, оборудование

1. Растворы аминокислот. Сначала готовят маточные растворы с концентрацией аминокислоты 40 мкмоль/мл. Для этого в 5 мл 0,01 н раствора HCI растворяют арг – 42 мг, гис – 42 мг, лиз – 36 мг, фен – 33 мг, тир – 36 мг, лей – 26 мг. Из них готовят рабочие растворы каждой аминокислоты, смешивая 0,1 мл маточного раствора и 0,9 мл 0,01 н раствора HCI. В полученных рабочих растворах содержится по 4 мкмоль/мл аминокислоты. 2. Стандартная смесь аминокислот готовится из полученных шести маточных растворов аминокислот, смешивая по 1 мл каждой и доводя общий объем до 10 мл 0,01 н раствором HCI. В полученной стандартной смеси содержатся аминокислоты, каждая из которых с концентрацией 4 мкмоль/мл. 3. Цитратный буфер, рН 5,28 (на 1 л буфера 24,6 г лимонной кислоты, 14,4 г NaOH, 6,8 мл 35% раствора HCI, 0,1 г фенола). 4. Нингидриновый реактив (раствор 1 – 1 г нингидрина в 100 мл ацетона; раствор 2 – 1 г ацетата кадмия в смеси 50 мл ледяной уксусной кислоты и 100 мл воды; рабочий раствор – 100 мл раствора 1 + 20 мл раствора 2).

Ход работы

На пластинке мягким карандашом наносят линию старта на расстоянии 1,5-2,0 см от нижнего края. На этой линии через равные промежутки отмечают 7 точек для нанесения растворов аминокислот. С помощью капилляров в точки наносят по 1,5 мкл (3 касания) рабочих растворов каждой из шести аминокислот и смеси аминокислот (одно касание – 0,5 мкл, что соответствует 210^-3 мкмоля каждой аминокислоты). Между касаниями пятно подсушивать феном. Нельзя царапать слой катионита капилляром! Таким образом в первые шесть точек внесены последовательно арг, гис, лиз, фен, тир, лей, а в седьмую точку – смесь аминокислот.

В сосуд для хроматографии налить цитратный буфер рН 5,28 на высоту 1 см и поместить пластинку с нанесенными образцами, Стартовая позиция смеси аминокислот должна быть выше уровня налитого буферного раствора, Для разделения аминокислот буфер должен подняться по пластинке ровным фронтом на высоту 15 см. Для этого требуется около двух часов. Процесс разделения можно значительно ускорить, предварительно пропитав пластинки в 10 раз разбавленным буфером и высушив их.

По окончании разделения пластинки вынуть из сосуда с буфером, нижние кромки промокнуть фильтровальной бумагой и пластинки высушить феном. Высушенные пластинки установить в наклонном положении в вытяжном шкафу и опрыснуть из пульверизатора нингидрином до равномерного пропитывания. Пластинки высушить и прогреть в термостате при 40-50 С 20 мин. Выявляются фиолетовые пятна аминокислот в последовательности снизу вверх: арг, гис, лиз, фен, тир, лей. Сравнить положение пятен стандартных растворов аминокислот с положением их при хроматографировании смеси аминокислот. Хроматограмму зарисовать в тетради.