Практикум

Работа № 1. Знакомство с питательными среды для культивирования изолированных клеток и тканей растений.

Основные компоненты питательных сред:

- макроэлементы (азот, фосфор, калий, кальций, сера, магний, железо);

- микроэлементы (бор, цинк, медь, марганец, кобальт, йод, молибден);

- витамины;

- аминокислоты, пептиды (гидрализаты казеина), углеводы (сахароза или глюкоза);

- фитогормоны (ауксины и цитокинины) и другие биорегуляторы;

- этилендиаминотетрауксусная кислота (ЭДТА).

Источники ауксинов в питательных средах - 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д), индолилуксусная кислота (ИУК), индолилмасляная кислота (ИМК), нафтилуксусная кислота (НУК); источники цитокининов - аденин, кинетин, 6-бензиламинопурин (6-БАП), зеатин, 2ip. Для регуляции роста используют гиббереловую кислоту (ГК). ИУК в 30 раз менее активна, чем 2,4-Д. Для индукции каллуса используют высокие концентрации 2,4-Д. Ауксины вызывают процессы дедифференцировки клетки, подготавливают ее к делению. Затем цитокинины инициируют деление клеток. Молекулярный механизм действия ауксинов связан с индукцией ими синтеза главной протеинкиназы клеточного деления Р₃₄^cdc2, а цитокинины индуцируют синтез циклинов, регулирующих прохождение клетки по клеточному циклу. Таким образом, действие этих биорегуляторов (растительных гормонов) проявляется только при последовательном или одновременном внесении их в среду.

Для культивирования клеток, тканей и органов растений используют следующие питательные среды.

Среда Мурасиге-Скуга

Компоненты питательной среды, мг/л
NH4NO3	1650	KJ	0,83
KNO3	1900	FeSO4×7H2O	27,8
CaCl2×2H2O	440	Na2EDTA×2H2O	37,3
MgSO4×7H2O	370	Тиамин-HCl	0,1
KH2PO4	170	Пиридоксин-HCl	0,5
MnSO4×4H2O	24,1	Никотиновая к-та	0,5
CoCl2×6H2O	0,025	Мезоинозит	100
ZnSO4×7H2O	8,6	Глицин	2,0
CuSO4×5H2O	0,025	Сахароза	3000
Na2MoO4×2H2O	0,25
рН 5,6-5,8

Среда Уайта

Компоненты питательной среды, мг/л
Ca(NO3)2	200	CuSO4×5H2O	0,02
MgSO4×7H2O	360	ZnSO4	1,5
Na2SO4	200	Na2MoO4×2H2O	0,0025
KNO3	80	KJ	0,75
KCl	65	Пиридоксин HCl	0,1
NaH2PO4	16,5	Тиамин-HCl	0,1
H3BO3	1,5	Никотиновая к-та	0,5
MnSO4	4,5	Глицин	3,0
Fe2(SO4)3	2,5	Сахароза	2000
рН 5,6-5,8

Среда Гамборга и Эвелега (В₅)

Компоненты питательной среды, мг/л
NaH2PO4	150	Na2EDTA×2H20	30,0
KNO3	1500	Na2MoO4×2H2O	0,25
(NH4)2SO4	134	KJ	0,75
MgSO4×7H2O	250	FeSO4×7H2O	28
CaCl2×2H2O	150	Тиамин-HCl	10
H3BO3	3,0	Пиридоксин HCl	1,0
MnSO4×4H2O	10,0	Никотиновая к-та	1,0
CoCl2×6H2O	0,025	Мезоинозит	100
CuSO4×5H2O	0,025	2,4-Д	2,0
ZnSO4×7H2O	2,0	Сахароза	2000
рН 5,8

1. Сравните составы трех питательных сред. Найдите отличия. Сгруппируйте составные компоненты питательных сред (макроэлементы, микроэлементы, молекулы пластического обмена, биорегуляторы, ЭДТА). Свяжите состав питательных сред с молекулярными процессами в культивируемых клетках, тканях, органах.

2. Питательные среды готовят из «маточных» растворов, которые хранят при низкой температуре. В «маточных» растворах повышена концентрация макроэлементов в 10-20 раз, микроэлементов – в 100-1000 раз, витаминов – в 1000 раз. Предложите варианты «маточных» растворов солей макроэлементов, Fe-хелата (FeSO₄×7H₂O + Na₂EDTA×2H₂0), солей микроэлементов, витаминов, биорегуляторов для быстрого приготовления рабочих питательных сред для культивирования.

Работа 2. Цветные реакции на белки и аминокислоты.

Диагностическое значение и принцип реакций. Цветные реакции дают возможность обнаружить присутствие белка в биологических жидкостях и получить представление об его аминокислотном составе.

Биуретовая реакция открывает пептидную связь в белке. Ее способны давать вещества, которые содержат не менее двух пептидных связей. При добавлении сернокислой меди к сильнощелочному раствору белка или полипептида образуются соединения меди с пептидной группировкой, окрашенные в красно-фиолетовый или сине-фиолетовый цвет в зависимости от длины полипептидной цепи. Раствор белка дает сине-фиолетовое окрашивание, а продукты неполного его гидролиза (пептоны) - розовое или красное окрашивание.

Нингидриновая реакция характерна для -аминогрупп. Растворы белка, -аминокислот и пептидов при нагревании с нингидрином дают синее или фиолетовое окрашивание. В этой реакции -аминокислоты и пептиды окисляются нингидрином и подвергаются окислительному дезаминированию и декарбоксилированию с образованием аммиака, альдегида и СО₂. Нингидрин восстанавливается и связывается со второй молекулой нингидрина посредством молекулы аммиака, образуя продукты конденсации, окрашенные в синий цвет (комплекс Руэмана). Нингидриновая реакция используется для количественного определения -аминокислот в аминокислотных анализаторах.

Ксантопротеиновая реакция открывает наличие в белках циклических аминокислот - триптофана, фенилаланина, тирозина, содержащих в своем составе бензольное ядро. Большинство белков при нагревании с концентрированной азотной кислотой дает желтое окрашивание, переходящее в оранжевое при подщелачивании. Реакция обусловлена нитрованием бензольного кольца этих аминокислот с образованием нитросоединений желтого цвета.

Реакция Миллона открывает в белке циклическую аминокислоту тирозин. При добавлении к раствору белка реактива Миллона, состоящего из смеси азотнокислых и азотистокислых солей закиси и окиси ртути, растворенных в концентрированной азотной кислоте, образуется белый осадок (действие соли тяжелого металла), окрашивающийся при нагревании в красный цвет. Реактив Миллона дает окрашивание почти со всеми фенолами, и в случае белков реакция обусловлена присутствием в них фенольной группы тирозина. Белки, не содержащие тирозина, этой реакции не дают. Следует избегать прибавления избытка реактива Миллона, поскольку он содержит азотную кислоту, которая при взаимодействии с белком может дать желтое окрашивание (ксантопротеиновую реакцию), маскирующее реакцию Миллона.

Реакция Фоля указывает на присутствие в белке аминокислот цистина и цистеина, содержащих слабосвязанную серу. Метионин, хотя и является содержащей серу аминокислотой, этой реакции не дает, поскольку сера в нем связана прочно. Реакция состоит в том, что при кипячении белка с реактивом Фоля (плюмбит натрия в избытке NaОН) под действием щелочи от цистеина или цистина легко отщепляется сера в виде сернистого натрия, который с плюмбитом дает черный или бурый осадок сернистого свинца.

Реактивы, исследуемый материал

1. Раствор едкого натра, 100 г/л. 2. Раствор сернокислой меди, 10 г/л. 3. Раствор нингидрина, 5 г/л. 4. Азотная кислота концентрированная. 5. Реактив Миллона. 6. Раствор фенола, 1 г/л. 7. Реактив Фоля. 8. Раствор яичного белка для цветных реакций.

Ход работы

Реагенты	Опыт	Контроль
Биуретовая реакция
Раствор белка	5 кап	-
Вода	-	5 кап
NaOH, 10%	5 кап	5 кап
CuSO4, 1%	2 кап	2 кап
Окрашивание
Нингидриновая реакция
Раствор белка	5 кап	-
Вода	-	5 кап
Раствор нингидрина	5 кап	5 кап
Кипятить 1-2 мин
Окрашивание
Ксантопротеиновая реакция
Раствор белка	5 кап	-
Вода	-	5 кап
HNO3, конц.	5 кап	5 кап
Кипятить до появления окраски раствора белка
Окрашивание
Реакция Милона
Раствор белка	5 кап	-
Вода	-	5 кап
Реактив Миллона	3 кап	3 кап
Нагреть до окрашивания осадка белка
Окрашивание
Реакция Фоля
Раствор белка	5 кап	-
Вода	-	5 кап
NaOH, 30%	5 кап	5 кап
(CH3COO)2Pb, 5%	1 кап	1 кап
Кипятить до появления черного окрашивания