Работа 13. Определение активности щелочной и кислой фосфатаз в сыворотке крови по гидролизу -глицерофосфата (метод Боданского), уирс.

Активность щелочной фосфатазы в норме равна 0,5-1,3 ммоль/чл, а кислой фосфатазы – 0,06-0,13 ммоль/чл. Принцип определения активности фосфатаз основан на способности ферментов отщеплять неорганический фосфат от -глицерофосфата. Для определения активности щелочной фосфатазы используют щелочной раствор -глицерофосфата, для кислой – кислый раствор -глицерофосфата.

Реактивы и исследуемый материал

1. Щелочной раствор -глицерофосфата, 5 г/л, рН 8,6. 2. Кислый раствор -глицерофосфата, 5 г/л, рН 5,0. 3. Раствор молибденовокислого аммония, 25 г/л (в 2,5 н растворе серной кислоты). 4. Раствор трихлоруксусной кислоты, 100 г/л. 5. Рабочий стандартный раствор фосфора (содержит 0,01 мг фосфора в 1 мл). 6. Раствор аскорбиновой кислоты, 10 г/л (в 0,1 н растворе HCI).

Ход работы

В центрифужную пробирку с надписью П_щ внести 1 мл щелочного раствора, в пробирку с надписью П_к - 1 мл кислого раствора -глицерофосфата и поместить их на 5 мин в термостат при 37 С для прогревания субстратов. Затем осторожно, избегая образования пузырьков воздуха, в пробирки внести по 0,1 мл сыворотки крови и полученную фермент-субстратную смесь инкубировать в течение 1 ч при 37 С. Время термостатирования опытных проб использовать для определения содержания неорганического фосфата в контрольных пробах. Для этого в центрифужные пробирки с надписью К_щ и К_к внести соответственно по 1 мл щелочного или кислого раствора -глицерофосфата, прилить по 1,1 мл раствора трихлоруксусной кислоты, после чего добавить по 0,1 мл той же сыворотки крови, пробы перемешать и через 5 мин центрифугировать в течение 10 мин при 3000 об/мин. Затем отобрать по 1,5 мл центрифугата и перенести в обычные пробирки с соответствующей маркировкой (К_щ и К_к), прибавить по 1 мл молибденового раствора, 1 мл раствора аскорбиновой кислоты, перемешать. Пробы выдерживают 10 мин при комнатной температуре, после чего их колориметрируют при красном светофильтре в кюветах шириной 5 мм. В качестве пробы сравнения используют дистиллированную воду. К опытным пробам после инкубации в термостате добавить по 1,1 мл раствора трихлоруксусной кислоты, перемешать и далее обработать и колориметрировать, как контрольные пробы. Активность щелочной и кислой фосфатаз рассчитывают, используя калибровочный график. Для построения калибровочной кривой готовят следующие растворы.

Реактивы	Номера пробирок
	1	2	3	4	5	6
Рабочий раствор Рн, мл	0,6	1,2	2,4	3,6	4,8	6,0
ТХУ, мл	2,5	2,5	2,5	2,5	2,5	2,5
Вода, мл	5,9	5,3	4,1	2,9	1,7	0,5
Перемешать
Отобрать в другие пробирки	1,5	1,5	1,5	1,5	1,5	1,5
Молибденовый раствор, мл	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
Аскорбиновая кислота	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
Содержание Рн (мг) в пробах	0,001	0,002	0,004	0,006	0,008	0,010

Через 10 мин после прибавления аскорбиновой кислоты пробы колориметрировать при красном светофильтре в кювете шириной 5 мм против дистиллированной воды. При построении калибровочной кривой на оси абсцисс откладывать содержание Рн в пробах, а на оси ординат – величины оптической плотности. В качестве единицы масштаба взять 10 мм на 0,001 мг фосфора.

По калибровочной кривой рассчитать число мг Рн в опытных и контрольных пробах.

Активность щелочной фосфатазы = (П_щ-К_щ)1,4710⁵/31 ммоль/чл

Активность кислой фосфатазы = (П_к-К_к)  1,4710⁵/31 ммоль/чл,

где (П_щ-К_щ) или (П_к-К_к) – количество Рн, которое освободилось при действии фосфатазы; 1,4710⁵ – коэффициент пересчета с 0,068 мл на 1 л сыворотки; 31 – масса 1 ммоля Рн (мг).