Комплекс Гольджи
Комплекс Гольджи (аппарат Гольджи) впервые увидел в нервных клетках итальянский ученый К. Гольджи в 1898 г., используя для окраски клеточных структур тяжелые металлы (осмий и серебро). Во многих клетках или в различные моменты функционирования одной и той же клетки эта структура имеет в световом микроскопе вид сеточки, поэтому ее иногда называют внутриклеточным сетчатым аппаратом. Усовершенствование метода окраски металлами (импрегнации) позволило обнаружить аппарат Гольджи в клетках разных тканей позвоночных и беспозвоночных животных, где он обычно расположен около ядра или вблизи клеточного центра. В растительных же клетках аппарат Гольджи долгое время найти не удавалось, но с появлением электронной микроскопии его элементы были выявлены во всех растительных клетках, где они, как правило, расположены по периферии клетки (рис. 13).
Рис. 13. Трехмерное изображение диктиосомы растительной клетки
Форма аппарата Гольджи в разных клетках весьма разнообразна. Он может быть представлен в клетке одним крупным комплексом мембранных структур (ситевидная форма), как, например это имеет место в большинстве тканей взрослого организма животных. В растительных клетках, в клетках беспозвоночных и эмбриональных тканей чаще встречается так называемая диктиосомная форма аппарата Гольджи, образованная системой связанных между собой изолированных комплексов. Между этими двумя формами аппарата нет принципиальной разницы: структура его изменяется при разных функциональных состояниях клетки и в процессе ее дифференцировки.
На электронных микрофотографиях наиболее типичная и постоянная структура аппарата Гольджи - это стопка плоских мембранных мешков, или цистерн, на периферии которых имеются ампулярные расширения (рис. 14). Число стопок Гольджи (диктиосом) колеблется в разных типах клеток от одной большой до нескольких сотен очень мелких. Обычно в отдельной стопке содержится 5-10 цистерн с диаметром около 1 мкм. Со стопками всегда ассоциировано множество вакуолей. На стороне, примыкающей к ЭПС, встречаются главным образом мелкие вакуоли. Они переносят белки и липиды, синтезированные в ЭПС, в аппарат Гольжди. Пузырьки обнаруживаются также в периферических участках зоны комплекса Гольджи; здесь они отшнуровываются от ампулярных расширений на краях плоских цистерн и транспортируют продукты между отдельными цистернами.
Рис.14. Электронная микрофотография аппарата Гольджи
Аппарату Гольджи свойственна морфологическая и функциональная полярность. В нем различают формирующуюся, или цис-сторону, обращенную к цитоплазме и ядру, и зрелую, транс-зону, направленную к поверхности клетки. Между ними располагается средний, или промежуточный, участок.
Транс-участок диктиосом, расширяясь, образует трубчатый ретикулум (транс-сеть аппарата Гольджи), от которого отходит масса вакуолей. Мембранные пузырьки со стороны цитоплазмы часто покрыты белком клатрином, благодаря чему приобретают своеобразную опушенность и поэтому называются окаймленными. В транс-сети происходят разделение и сортировка продуктов секреции клетки.
Внутриклеточный сетчатый аппарат наиболее развит в клетках, специализированных на выполнение секреторной функции: бакаловидных клетках эителия кишечника; эндокринных клетках поджелудочной и других желез; гепатоцитах, фибробластах и т.д. В мембранных элементах комплекса Гольджи осуществляется сегрегация и накоплении продуктов, синтезированных в ЭПС, их х
Методом электронной радиоавтографии показано, что процесс синтеза и выведения секрета из клетки высоко упорядочен. На примере некоторых железистых клеток показано, что на первом этапе синтезированный на рибосомах белковый продукт проникает внутрь ЭПС, накапливаются в полостях цистерн и транспортируются к зоне мембран комплекса Гольджи. Из ЭПС белки с помощью транспортных пузырьков переносятся сначала в цистерну цис-зоны диктиосомы. Здесь мембраны пузырьков сливаются с мембранами цистерн, в результате чего белки оказываются внутри полостей цистерн аппарата Гольджи. Затем белковый продукт переходит в следующий (промежуточный) компартмент и далее последовательно переносится от цистерны к цистерне и, наконец, поступает в транс-зону диктиосомы. В конечном счете, белки достигают трубчатой мембранной транс-сети, где происходит отщепление пузырьков, содержащих уже зрелый продукт. При сливании отделившихся от транс-сети мелких пузырьков образуются довольно крупные секреторные вакуоли, которые начинают двигаться к плазматической мембране. После того, как секреторная вакуоль сольется с плазматической мембраной, ее содержимое оказывается за пределами клетки, т.е. осуществляется экзоцитоз.
Таким образом, продукты клеточного синтеза, попадая в комплекс Гольжди, подвергаются ступенчатому переносу через стопку цистерн. Причем перемещение от цис-зоны через промежуточный компартмент к транс-зоне осуществляется не напрямую, а с помощью пузырьков, которые на каждом этапе отшнуровываются от цистены диктиосомы и затем сливаются с мембраной следующей цистерны.
Аналогичный механизм переноса имеет место не только при формировании секреторных вакуолей. Белки, предназначенные для лизосом и плазматической мембраны, также движутся последовательно от одной цистерны к другой, пока не достигнут транс-сети. В трубчатом ретикулуме осуществляется сортировка продуктов синтеза: они распределяются в различные транспортные пузырьки и отправляются к пунктам конечного назначения – секреторным пузырькам, лизосомам или плазматической мембране. Таким же способом перемещаются по компартментам комплекса Гольджи синтезированные в клетках липиды. Белки и липиды, являющиеся компонентами клеточных мембран, в отличие от содержимого полостей вакуолей, еще в шероховатой ЭПС образуют бислои, в которые встраиваются белки, и уже в составе мембран они перемещаются по комплексу Гольджи.
Комплексу Гольджи свойственна не только морфологическая, но и функциональная полярность. Белковые и липидные продукты, проходя один за другим все мембранные компартменты комплекса Гольджи, претерпевают последовательные серии биохимических модификаций. Вновь синтезированные секреторные и мембранные белки, а также мембранные липиды, первично гликозилированные в ЭПС, сначала попадают в цис-зону. Здесь и далее при прохождении через цистерны сетчатого аппарата они подвергаются специфическому действию ферментов. Каждая цистерна, при этом, представляет собой отдельный компартмент, содержащий собственный набор ферментов.
К числу основных биохимических процессов, протекающих в комплексе Гольджи, относятся следующие:
Вторичное гликозилирование белков и липидов;
Гликозилирование и сборка протеогликанов;
Добавление маннозо-6-фосфата (М-6-Ф) – сигнала сортировки лизосом.
.
В шероховатой ЭПС, как уже указывалось выше, гликозилирование заключается в присоединении к соответствующему остатку аспарагина растущей пептидной цепи олигосахаридного компонента. После этого с помощью гликозидаз происходит удаление углеводных остатков, завершающееся образованием гликопротеидов с одинаковым количеством моносахаридов в олигосахаридной цепи. В результатете все белки, покидающие ЭПС, состоят из двух молекул N-ацетилглюкозамина и шести молекул маннозы. Такие белки, связанные с олигосахаридами, направляются в комплекс Гольджи.
Реакции, в результате которых образуются сложные олигосахариды, происходят по строго упорядоченной схеме, где каждая стадия зависит от предыдущей реакции в серии. На разных этапах синтеза используются различные ферменты, а продукт каждой реакции узнается в качестве субстрата для следующей. В первых цистернах сетчатого комплекса осуществляется вторичная модификация олигосахаридных цепей. В цис-зоне происходит фосфорилирование углеводных компонентов гидролитических ферментов, в транс-зоне - сульфатирование некоторых белков.
В последнюю очередь белки, предназначенные для секреции, подвергаются протеолизу. Расщепление белка протеазами начинается в транс-сети аппарата Гольджи и продолжается уже в секреторных пузырьках. Модификация такого рода свойственна многим полипептидным гормонам и нейропептидам, которые синтезируются в форме неактивных белков-предшественников, превращение которых в активные молекулы достигается путем отщепления от него пептидного фрагмента.
Завершающим этапом переноса белков и липидов через комплекс Гольджи является сортировка – внутриклеточное распределение синтезированных в клетке продуктовв зависимости от места их конечного назначения в клетке. В настоящее время хорошо изучены три пути сортировки белков в комплексе Гольджи. Гидролитические ферменты направляются в лизосомы; экспортируемые белки накапливаются и концентрируются в секреторных пузырьках и выделяются из клетки в ответ на внешний сигнал. Этот путь существует только в специализированных секреторных клетках. Третью группу составляют белки, направляющиеся непосредственно к плазматической мембране.
Существует специальный механизм пространственного разделения разных белков, обеспечивающий пути их дальнейшего следования в соответствии с местом назначения в клетке. Известно, что в цис- и промежуточной зонах диктиосом все эти белки идут вместе без разделения, лишь подвергаясь модификации в зависимости от их олигосахаридных маркеров. Непосредственно сортировка происходит в транс-сети аппарата Гольджи: здесь из множества белков отбираются и упаковываются в соответствующие пузырьки только строго определенные белки. Для этого белки, направляющиеся лизосомы или секреторные вакуоли, должны иметь специальный сигнал сортировки.
Наиболее полно процесс сортировки изучен на примере лизосомных ферментов. Они имеют уникальный маркер - маннозо-6-фосфат, группировку, образующуюся в олигосахаридной части гидролитических ферментов лизосом в пространстве цис-зоны аппарата Гольджи. С ее помощью осуществляется сортировка в транс-сети комплекса Гольджи, где расположен соответствующий мембранный белок-рецептор. В результате узнавания и связывания лизосомных гидролаз рецептором М-6-Ф они отделяются от всех остальных белков и упаковываются в пузырьки.
Что касается секреторных белков, то для них сигнал сортировки неизвестен. Предполагается, однако, что подобно лизосомным гидролазам, они в транс-сети аппарата Гольджи избирательно упаковываются в соответствующие пузырьки. Внутри секреторных пузырьков растворимые белки, выводимые из клетки, агрегируются и концентрируются, при этом концентрация белка может возрасти примерно в 200 раз по сравнению с концентрацией в полости ЭПС. Их называют секреторные гранулы, что отражает морфологические особенности, определяемые под электронным микроскопом (рис. 15). В секреторных гранулах белок хранится до тех пор, пока клетка не получит сигнал, вызывающий их секрецию.
Рис. 15. Электронная микрофотография секреторных гранул, содержащих инсулин, в β-клетках поджелудочной железы
При переносе пузырьков от одного компартмента вакуолярной системы к другому мембраны, как и внутреннее содержимое органелл, должны сохранять свойственные разным структурам особенности химического состава. Поддержание уникальности строения мембран обеспечивается также внутриклеточной сортировкой. Существуют различные типы транспортных пузырьков, содержащие на своей поверхности молекулярные метки (сигналы сортировки), с помощью которых вакуоли направляются только к определенной мембране. Высокоспецифичное узнавание обеспечивает сливание мембранных пузырьков, отпочковавшихся от ЭПС с мембраной цис-зоны аппарата Гольджи, вакуолей, покидающих этот компартмент – промежуточным компартментом.т.д.
Помимо передвижения везикул от ЭПС к плазматической мембране (антероградный транспрот) через аппарат Гольджи осуществляется и обратный поток – ретроградный транспорт. Такой механизм необходим для регуляции и поддержания состава мембран каждой органеллы. В противном случае, размеры одного компартмента постепенно бы уменьшались, а другого, напротив, - непомерно возрастали. Известно, что некоторые белки возвращаются из цис-зоны аппарата Гольджи к ЭПС. В частности ретроградно-транспортируемыми являются молекулы рецепторных белков, ответственных за связывание растворимых белков ЭПС. Вакуоли, отделившиеся от вторичных лизосом, могут вместе с рецепторными белками возвращаться в зону транс-зону. Ссуществует также поток вакуолей от транс-зоны к цис-зоне аппарата Гольджи. Благодаря ему возвращаются различные ферменты вторичного гликозилирования и рецепторные белки в составе мембран.
В промежуточном компартменте аппарата Гольджи происходит удаление остатков манноз и присоединение N-ацетилглюкозамина. При дальнейшем созревании секреторных белков уже в транс-зоне к стержневой структуре олигосахарида с помощью специализированных гликозилтрансфераз добавляюся галактоза и сиаловая кислота. При этом каждая гликозилтрансфераза распознает развивающуюся углеводную структуру и добавляет к цепи свой собственный остаток углевода. Гликозилтрансферазы работают в строго определенной последовательности. Субстратом для них служат специфические активированные нуклеотид-сахара. Они транспортируются в полости аппарата Гольджи при помощи набора связанных с мембраной носителей. Аналогичные превращения происходят и с гликопротеидами, направляющимися к плазматической мембране.
В некоторых типах клеток животных аппарат Гольджи участвует в сборке протеогликанов - комплекса гликозаминогликанов (длинных неразветвленных полисахаридных цепей, состоящих их повторяющихся дисахаридных единиц) и белков. Протеогликаны либо секретируются в качестве компонента внеклеточного матрикса соединительной ткани, либо образуют защитное покрытие многих эпителиев. Кроме того, протеогликаны могут оставаться в составе плазматической мембраны. В отличие от гликопротеидов, гликозилирование здесь осуществляется в результате присоединения молекул сахаров к остаткам серина или треонина (О-связанное гликозоирование). Процесс гликозилирования катализируется также специфическими гликозилтрансферазами путем полимеризации одной или нескольких цепей. После образования олигосахаридной цепи протеогликанов происходят многочисленные дополнительные химические модификации, в первую очередь, сульфатирование сахаров, благодаря чему протеогликаны приобретают высокий отрицательный заряд.
В растительных клетках в комплексе Гольджи происходит синтез полисахаридов матрикса клеточной стенки (гемицеллюлоз, пектинов), а также слизей и муцинов.
Важнейшая функция комплекса Гольджи заключается в обеспечении круговорота мембран. Во всех типах клеток транспортные пузырьки, отделившиеся от аппарата Гольджи, непрерывным потоком движутся к плазматической мембране, где происходит слияние этих мембран. Этот механизм обеспечивает плазматическую мембрану вновь синтезированными интегральными белками и липидами. Существует предположение, что к клеточной поверхности добавляются все белки, которые не имеют специальных сигналов сортировки для включения их в лизосомы или в пузырьки, предназначенные для секреции. Следовательно, в отличие от избирательного движения белков в специализированных секреторных клетках, белки, включающиеся в плазматическую мембрану, автоматически доставляются к клеточной поверхности (за исключением поляризованных клеток, где белковый и липидный состав мембран в ее разных участках достаточно сильно различается и поэтому транспортные пути работают избирательно). Этот тип секреции, свойственный фактически всем клеткам, получил название конститутивной, в противоположность регулируемой секреции, при которой растворимые белки и другие вещества сначала накапливаются в секреторных пузырьках, а затем по сигналу высвобождаются.
В процессе гликозилирования мембранных белков и липидов образуются структурные элементы надмембранной части поверхностного аппарата клеток. Именно они определяют специфику клеточной поверхности, обеспечивают адгезию клеток друг с другом и компонентами внеклеточного матрикса, а также функционирование основной рецепторной системы клеток и т.д. Таким образом, сформированные в комплексе Гольджи мембранные пузырьки, несущие характерные ансамбли, углеводов, ковалентно связанных с белками и липидами, далее уже в готовом виде встраиваются в гликокаликс плазматической мембраны.
Присоединение олигосахаридов происходит со стороны внутреннего пространства ЭПС и комплекса Гольджи. Такое асимметричное расположение углеводов сохраняется в процессе транспорта к секреторным пузырькам, плазматической мембране и лизосомам. В итоге олигосахаридные компоненты всех гликопротеидов и гликолипидов в соответствующих структурах обращены в их просвет, а в плазматической мембране – во внеклеточное пространство.
На противоположной (цитозольной) стороне мембраны пузырьков в транс–сети комплекса Гольджи формируется белковое покрытие. В транспорте, управляемом сигналами, решетчатую структуру на поверхности мембраны образует белок клатрин. После того, как пузырек полностью сформируется, клатриновая кайма удаляется. Такие же окаймленные пузырьки формируются из плазматической мембраны при ее инвагинации в процессе опосредованного рецепторами эндоцитоза. Что касается неизбирательного транспорта от транс-сети Гольджи к поверхности клетки, то здесь формируются окаймленные пузырьки, покрытые белками другого типа.
Следует заметить, что сливание мембраны секреторных пузырьков постоянно сопровождается увеличением поверхности плазматической мембраны. Однако такое увеличение возникает ненадолго, поскольку участки мембраны постоянно удаляются с поверхности путем эндоцитоза, т.е. имеет место рециркуляция мембран. В результате круговорота мембран площадь поверхности клетки сохраняется на одном уровне.