2.3 Виділення та визначення вмісту білку за методом Бредфорд

Визначення вмісту білку в насінні проводили за методом Бредфорд [76]. Цей метод заснований на утворенні кольорових комплексів білка з розчином барвника (Coomassie G250 – кумасі діамантово-блакитного). При зв’язуванні з білками спектр поглинання барвника змінюється. Приготування розчину барвника. 10мг барвника G-250 гомогенізують у склянному гомогенізаторі у 5мл 95%-ного спирту. Отриманий розчин змішують з 10мл 95%-ної фосфорної кислоти, розводять водою до об’єма 100мл. Профільтрований розчин барвника зберігається при кімнатній температурі два тижні.

2.4 Визначення ізоферментного складу пероксидази методом ізоелектричного фокусування в поліакриламідному гелі

2. 5 Визначення активності та ізоферментного складу пероксидази

Метод визначення активності пероксидази заснований на вимірі часу, за який досліджуваний розчин досягає визначеної оптичної щільності. Як субстрат використовується бензидин, в результаті окиснення якого утвориться сполука синього кольору. Для виміру краще брати такі розведення витяжки, щоб зміна фарбування відбувалася за 10-40с. Активність пероксидази визначали за методом Бояркіна А.Н. [14]. До рослинного екстракту об'ємом 0,2 мл додавали 0,8 мл буферного розчину і 1 мл розчину бензидину на ацетатному буфері. Після чого вимірювання проводили на ФЕК при довжині хвилі 480 нм. Безпосередньо перед вимірюванням у кювету додавали 1 мл 1%-ного розчину перекису водню. Вимірювання проводили у циклічному режимі: 5 циклів по 10 сек. протягом 1 хв. Контролем слугував розчин, який складався з 1 мл буферу + 1 мл бензидину + 1 мл перекису.

Загальну активність пероксидази розраховували за формулою:

А = Д * а * в / с * t * H, де

Д – величина оптичної густини, яка знайдена експериментальним шляхом у циклі; а – об'єм витяжки; в – ступінь розведення витяжки в реакційній суміші; с – товщина рідини у кюветі, яка відповідає 1 см; t – час циклічного режиму; H – наважка рослинного матеріалу. Ізоферментий склад пероксидазної системи визначали, використовуючи метод ізоелектричного фокусування (ІЕФ) в поліакриламідному гелі з гістохімічним забарвленням на пероксидазу в діапазоні рН 3,5–6,5 [32]. Для проведення ІЕФ в горизонтальних пластинках використовували апарат Ультрафор 2197 (LKB, Швеція). Безпосередньо перед початком роботи з геля обережно знімали верхню пластину. Потім на поверхню геля накладали смужки товстого фільтрувального паперу, змочені католітом (1 м NaOH) і анолітом (0,04 М α-глутамінова кислота). Після цього пластинку геля розміщували на поверхні блоку охолодження. Для ефективного відведення тепла між пластинкою і охолоджуючою поверхнею повинен бути шар рідини. Для цього був використаний Brij35. Розчин зразка наносили на гельову пластинку за допомогою прямокутних шматочків фільтрувального паперу розміром 7х5 мм.

На початку експерименту проводили попереднє ІЕФ, при цьому величина напруги становила 300 В, струму – 30 мА, потужності – 15 Вт. Початкові параметри дорівнювали: напруга – 300 В (const), струм – 11,5 мА, потужність – 6,5 Вт. В процесі фокусування через збільшення опору напруга зростала. При нанесенні білка було встановлено наступні параметри: 600 В, 10,5 мА, 7,0 Вт. По закінченні фокусування величина напруги дорівнювала – 1000 В; струму – 6,5 мА, потужності – 5,5 Вт. В цих умовах фокусування йшло 2 години.

Приготування бензидину. Запасний розчин: у 100 мл 7%-вої оцтової кислоти розчиняли 16 г натрію оцтовокислого і додавали 100 мг ЕДТА, потім фільтрували. Фільтрат насичували бензидином (100 мг) і знову фільтрували. Фільтрат зберігали у темній склянці у холодному місці.

Інкубаційне середовище для гістохімічного забарвлення гелю на пероксидазу: 9 мл запасного розчину, 1 мл 0,1 % свіже виготовленого розчину перекису водню, декілька кришталиків нітроропрусида (20 мг). Гелієву пластинку заливали інкубаційною середою. У зонах з пероксидазною активністю з'являлося блакитне забарвлення. Середу зливали і заливали водою. Зберігали у холодному, темному місці.

Для співставлення результатів фракціонування білків, їх ідентифікації і визначення значень рI після закінчення ізоелектрофокусування, здійснювали вимірювання pH вдовж градієнта шляхом екстрагування водою шматочків гелю (1x1см) і побудування кривої фактичного градієнта pH.

Рис. 1 – Калібрувальна крива залежності відстані, пройденого білком, від рН