2.4 Визначення ізоферментного складу пероксидази методом ізоелектричного фокусування в поліакриламідному гелі

Метод визначення активності пероксидази заснований на вимірі часу, за який досліджуваний розчин досягає визначеної оптичної щільності. Як субстрат використовується бензидин, в результаті окиснення якого утвориться сполука синього кольору[4,12]. Для виміру краще брати такі розведення витяжки, щоб зміна фарбування відбувалася за 10-40с. Активність пероксидази визначали за методом Бояркіна А.Н. [14]. До рослинного екстракту об'ємом 0,2 мл додавали 0,8 мл буферного розчину і 1 мл розчину бензидину на ацетатному буфері. Після чого вимірювання проводили на ФЕК при довжині хвилі 480 нм. Безпосередньо перед вимірюванням у кювету додавали 1 мл 1%-ного розчину перекису водню. Вимірювання проводили у циклічному режимі: 5 циклів по 10 сек. протягом 1 хв. Контролем слугував розчин, який складався з 1 мл буферу + 1 мл бензидину + 1 мл перекису[5].

Загальну активність пероксидази розраховували за формулою:

А = Д * а * в / с * t * H, де

Д – величина оптичної густини, яка знайдена експериментальним шляхом у циклі; а – об'єм витяжки; в – ступінь розведення витяжки в реакційній суміші; с – товщина рідини у кюветі, яка відповідає 1 см; t – час циклічного режиму; H – наважка рослинного матеріалу[9]. Ізоферментий склад пероксидазної системи визначали, використовуючи метод ізоелектричного фокусування (ІЕФ) в поліакриламідному гелі з гістохімічним забарвленням на пероксидазу в діапазоні рН 3,5–6,5 [32]. Для проведення ІЕФ в горизонтальних пластинках використовували апарат Ультрафор 2197 (LKB, Швеція). Безпосередньо перед початком роботи з геля обережно знімали верхню пластину. Потім на поверхню геля накладали смужки товстого фільтрувального паперу, змочені католітом (1 м NaOH) і анолітом (0,04М α-глутамінова кислота). Після цього пластинку геля розміщували на поверхні блоку охолодження[14,30]. Для ефективного відведення тепла між пластинкою і охолоджуючою поверхнею повинен бути шар рідини. Для цього був використаний Brij35. Розчин зразка наносили на гельову пластинку за допомогою прямокутних шматочків фільтрувального паперу розміром 7х5 мм[4,34].

На початку експерименту проводили попереднє ІЕФ, при цьому величина напруги становила 300 В, струму – 30 мА, потужності – 15 Вт. Початкові параметри дорівнювали: напруга – 300 В (const), струм – 11,5 мА, потужність – 6,5 Вт. В процесі фокусування через збільшення опору напруга зростала. При нанесенні білка було встановлено наступні параметри: 600 В, 10,5 мА, 7,0 Вт. По закінченні фокусування величина напруги дорівнювала – 1000 В; струму – 6,5 мА, потужності – 5,5 Вт. В цих умовах фокусування йшло 2 години[35,8,1].

Приготування бензидину. Запасний розчин: у 100 мл 7%-вої оцтової кислоти розчиняли 16г натрію оцтовокислого і додавали 100 мг ЕДТА, потім фільтрували. Фільтрат насичували бензидином (100 мг) і знову фільтрували. Фільтрат зберігали у темній склянці у холодному місці[3]. Інкубаційне середовище для гістохімічного забарвлення гелю на пероксидазу: 9 мл запасного розчину, 1 мл 0,1 % свіже виготовленого розчину перекису водню, декілька кришталиків нітроропрусида (20 мг)[6]. Гелієву пластинку заливали інкубаційною середою. У зонах з пероксидазною активністю з'являлося блакитне забарвлення. Середу зливали і заливали водою. Зберігали у холодному, темному місці[11]. Для співставлення результатів фракціонування білків, їх ідентифікації і визначення значень рI після закінчення ізоелектрофокусування, здійснювали вимірювання pH вдовж градієнта шляхом екстрагування водою шматочків гелю (1x1см) і побудування кривої фактичного градієнта pH.