Лабораторная работа № 2

Тема: Принципы составления питательных сред в биотехнологическом производстве.

Цель: Ознакомиться с основными принципами составления питательных сред для культивирования микроорганизмов. Изучить потребности микроорганизмов в основных источниках питания.

Вопросы для обсуждения:

1. Понятие «питательный субстрат» и его характеристики. Питательные среды для выращивания объектов биотехнологии, т. е. продуцентов тех или иных соединений, могут быть неопределенного состава и включать различные биогенные добавки (растительные, животные или микробные) – мясной экстракт, кукурузную муку, морские водоросли и т. п. Применяются также среды из чистых химических соединений определенного состава, так называемые синтетические.

Компонентный состав сред определяется питательными потребностями продуцента. Во многих процессах используют в качестве объектов организмы, ранее называвшиеся гетеротрофами, которые в настоящее время подразделяются на: органо автотрофы (употребляющие органические вещества как источники энергии), литогетеротрофы (использующие органические вещества как источники углерода) и органогетеротрофы (для которых органические вещества служат и источниками энергии, и источниками углерода).

Питательные среды призваны обеспечивать жизнеспособность, рост и развитие соответствующих продуцентов, а также синтез целевого продукта с максимальной эффективностью.

Требования к питательным средам, используемым в биотехнологии, ничем не отличаются от требований, предъявляемым к питательным средам, применяемым в микробиологии для культивирования тех или иных микроорганизмов.

• Для приготовления питательных сред в биотехнологии используются разнообразные субстраты, которые должны удовлетворять определенным критериям.

• Субстрат представляет собой сырье для получения целевого продукта и должен быть недефицитным, дешевым, по возможности легко доступным.

• Растительная биомасса и (в меньшей степени) биомасса животных организмов представляют собой достаточно хорошо утилизируемые источники углерода для биотехнологических целей.

• Быть питательными, т.е. содержать в легко усвояемом виде все вещества, необходимые для удовлетворения пищевых и энергетических потребностей. При культивировании ряда микроорганизмов в среды вносят факторы роста - витамины, некоторые аминокислоты, которые клетка не может синтезировать.

• Иметь оптимальную концентрацию водородных ионов - pH, т.к. только при оптимальной реакции среды, влияющей на проницаемость оболочки, микроорганизмы могут усваивать питательные вещества.

Для большинства патогенных бактерий оптимальна слабощелочная среда (pH 7,2-7,4). Исключение составляют холерный вибрион - его оптимум находится в щелочной зоне (pH 8,5-9,0) и возбудитель туберкулёза, нуждающийся в слабокислой реакции (pH 6,2-6,8).

Чтобы во время роста микроорганизмов кислые или щелочные продукты их жизнедеятельности не изменили pH, среды́ должны обладать буферностью, т.е. содержать вещества, нейтрализующие продукты обмена.

• Быть изотоничными для микробной клетки; т.е. осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки. Для большинства микроорганизмов оптимальная среда, соответствующая 0,5% раствору натрия хлорида.

• Быть стерильными, т.к. посторонние микробы препятствуют росту изучаемого микроба, определению его свойств и изменяют свойства среды.

• Плотные среды́ должны быть влажными и иметь оптимальную для микроорганизмов консистенцию.

• Обладать определённым окислительно - восстановительным потенциалом, т.е. соотношением веществ, отдающих и принимающих электроны, выражаемым индексом RH2. Например, анаэробы размножаются при RH2, не выше 5, а аэробы - при RH2 не ниже 10.

• Быть по возможности унифицированным, т.е. содержать постоянное количество отдельных ингредиентов.

• Желательно, чтобы среды́ были прозрачными - удобнее следить за ростом культур, легче заметить загрязнение среды посторонними микроорганизмами.

2. Источники углерода, используемые в биотехнологическом производстве.

Легкодоступными считаются сахара: глюкоза, сахароза, лактоза, за ними следуют многоатомные спирты: глицерин, маннит и др. Далее следуют полисахариды: целлюлоза, гемицеллюлоза, крахмал, которые могут быть источниками углерода либо после превращения их в усвояемые микроорганизмами моно- и низкомолекулярные олигосахариды, либо микроорганизмы должны иметь набор ферментов, гидролизующих эти вещества. Такими микроорганизмами являются плесневые грибы родов Aspergillus, Penicillium, бактерии рода Bacillus и другие.

На практике встречается большое количество микроорганизмов, которые успешно утилизируют органические кислоты, особенно в анаэробных условиях.

Низкомолекулярные спирты: метанол и этанол - относятся к числу перспективных видов сырья. Многие дрожжи родов Candida, Hansenula и др. способны ассимилировать этанол. Дрожжи родов Pichia, Candida и другие, бактерии рода Flavobacterium используют в качестве единственного источника углерода метанол.

Некоторые виды микроорганизмов (незначительная часть) используют в качестве источника углерода и энергии углеводороды: н-алканы и некоторые фракции нефти.

3. Источники азота, используемые в биотехнологическом производстве.

Азот может содержаться в форме неорганических солей или кислот. Большинство дрожжей хорошо усваивает аммиачные соли, а также аммиак из водного раствора, потребность в нитратах испытывают только некоторые виды дрожжей. Источником азота могут служить и органические соединения: аминокислоты, мочевина и т.д., которые легко усваиваются микроорганизмами.

Известно, что бактерии более требовательны к источникам азота, чем другие микроорганизмы (грибы, актиномицеты и дрожжи).

4. Способы внесения фосфора в питательную среду.

Фосфор является важнейшим компонентом клетки. Он входит в состав АТФ (аденозинтрифосфата), АДФ, АМФ и тем самым обеспечивает нормальное течение энергетического обмена в клетке, а также синтез белков, нуклеиновых кислот и другие процессы биосинтеза. Фосфор вносят в среду в виде солей фосфорной кислоты.

5. Способы внесения источников витаминов и микроэлементов в питательную среду.

Потребность микроорганизмов в этих соединениях различна, тем не менее, практически все микроорганизмы лучше растут в присутствии витаминов. Эффективной добавкой к питательным средам оказался кукурузный экстракт благодаря наличию в нем витаминов, аминокислот и минеральных элементов в легко ассимилируемых формах. В рецептуры сред включают также дрожжевой автолизат, дрожжевой экстракт, сок картофеля, молочную сыворотку, экстракт солодовых ростков и другие продукты. Микроэлементы в состав питательных сред вводят в микродозах, в противном случае они оказывают ингибирующее действие на микробные клетки.

6. Способы определения содержания сухих веществ в питательной среде.

Определение проводят с помощью рефрактометра. Перед началом работы рефрактометр проверяют по дистиллированной воде, при этом пунктирная линия, нанесенная на окуляр, должна совместиться с границей света и тени на нулевой отметке шкалы, значение при этом составляет 1,333.

Самостоятельная работа

1. По методически указаниям необходимо усвоить этапы приготовления питательных сред:

1.      Подготовить питательную среду.

Для этого:

        Среду заданного состава (табл. 1) приготовить в колбах на 250 мл. Все компоненты растворить в небольшом количестве водопроводной воды, затем объем довести до 100 мл водопрводной водой. Колбы со средой закрыть ватными пробками.

2. Определить рН питательной среды.

Для этого:

        В стеклянный стаканчик отобрать 25 мл содержимого каждой из колб и с помощью иономера определить рН среды.

3. Определить содержание сухих веществ в питательной среде с помощью рефрактометра.

Для этого:

        Перед началом работы рефрактометр проверить по дистиллированной воде, при этом пунктирная линия, нанесенная на окуляр, должна совместиться с границей света и тени на нулевой отметке шкалы, значение при этом составит 1,333;

        Затем на призмы с помощью стеклянной палочки нанести несколько капель исследуемой жидкости. Верхнюю призму опустить и плотно прижать к нижней. После этого переместить окуляр вдоль прорези, пока граница света и тени не совместится с пунктирной линией. По шкале прибора отметить деление, через которое проходит граница светотени;

        После определения поверхность призмы протереть фильтровальной бумагой и промыть дистиллированной водой;

4. Колбы с питательными средами поместить в автоклав для стерилизации.

5. Подготовить суспензию микроорганизмов и посеять в стерильную питательную среду.

Для этого:

        В пробирку с чистой культурой микроорганизма-продуцента вблизи пламени спиртовки налить 9 мл стерильной воды;

        Бактериологической петлей осторожно собрать колонии продуцента, содержащие споры, для образования суспензии;

        Посеять микробную суспензию стерильными пипетками. Из пробирки отобрать по 1 мл суспензии и количественно перенести в каждую колбу с питательной средой;

        Колбы закрыть ватными пробками; подписать (группа, фамилия, вариант среды) и установить в термостат на 7 суток при температуре 27°С.

Таблица 1

Варианты питательных сред

Компоненты,	Вариант
на 100 мл среды	1	2	3	4	5	6
Сахароза, г	-	3	-	-	-	-
Глюкоза, г	3	-	-	3	6	3
Лактоза, г	-	-	3	-	-	-
Na NO3 (20% р-р), мл	5	5	5	5	10	5
KH2PO4 (10% р-р), мл	2	2	2	2	4	2
KСl (5% р-р), мл	1	1	1	1	2	1
MgSO4×7H2O (1% р-р), мл	1	1	1	1	2	1
FeSO4×7H2O (1% р-р), мл СаО ( 10 % р-р ), мл Витамины РН	1 0,3 - 6,5-6,8	1 0,3 - 6,5-6,8	1 0,3 - 6,5-6,8	1 0,3 + 6,5-6,8	2 0,6 - 6,5-6,8	1 0,3 - 4

2. В тетради записать функциональную характеристику ингредиентов вариантов питательных сред № 3 и 5.