Применение фагов в биотехнологии, микробиологии и медицине.

Практическое применение фагов. Бактерио­фаги используют в лабораторной диагнос­тике инфекций при внутривидовой иденти­фикации бактерий, т. е. определении фаговара (фаготипа). Для этого применяют метод фаготипирования, основанный на строгой специфичности действия фагов: на чашку с плотной питательной средой, засеянной «газоном» чистой культурой возбудителя, на­носят капли различных диагностических типоспецифических фагов. Фаговар бактерии определяется тем типом фага, ко­торый вызвал ее лизис (образование сте­рильного пятна, «бляшки», или «негативной колонии», фага). Методику фаготипирова­ния используют для выявления источника и путей распространения инфекции (эпидеми­ологическое маркирование). Выделение бак­терий одного фаговара от разных больных указывает на общий источник их заражения.

По содержанию бактериофагов в объектах окружающей среды (например, в воде) можно судить о присутствии в них соответствующих патогенных бактерий. Подобные исследова­ния проводят при эпидемиологическом ана­лизе вспышек инфекционных болезней.

Фаги применяют также для лечения и про­филактики ряда бактериальных инфекций. Производят брюшнотифозный, сальмонеллезный, дизентерийный, синегнойный, ста­филококковый, стрептококковый фаги и комбинированные препараты (колипротейный, пиобактериофаги и др.). Бактериофаги назначают по показаниям перорально, парен­терально или местно в виде жидких, таблетированных форм, свечей или аэрозолей.

Бактериофаги широко применяют в генной инженерии и биотехнологии в качестве векторов для получе­ния рекомбинантных ДНК.

Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам.

Для определения чувствительности бак­терий к антибиотикам (антибиотикограммы) обычно применяют:

•  Метод диффузии в агар. На агаризованную питательную среду засевают исследуемый микроб, а затем вносят антибиотики. Обычно препараты вносят или в специальные лунки в агаре, или на поверхности посева раскла­дывают диски с антибиотиками («метод дис­ков»). Учет результатов проводят через сутки по наличию или отсутствию роста микробов вокруг лунок (дисков). Метод дисков — качес­твенный и позволяет оценить, чувствителен или устойчив микроб к препарату.

• Методы определения минимальных ингибирующих и бактерицидных концентраций, т. е. минимального уровня антибиотика, кото­рый позволяет in vitroпредотвратить видимый рост микробов в питательной среде или пол­ностью ее стерилизует. Это количественные методы, которые позволяют рассчитать дозу препарата, так как концентрация антибиоти­ка в крови должна быть значительно выше ми­нимальной ингибирующей концентрации для возбудителя инфекции. Введение адекватных доз препарата необходимо для эффективного лечения и профилактики формирования ус­тойчивых микробов.

Есть ускоренные способы, с применением автоматических анализаторов.

Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом дисков. Исследуемую бактериальную культуру засевают газоном на питательный агар или среду АГВ в чашке Петри.

Среда АГВ: сухой питательный рыбный бульон, агар-агар, натрий фосфат двузамещенный. Среду готовят из сухого порошка в соответствии с ин­струкцией.

На засеянную поверхность пинцетом помещают на одинако­вом расстоянии друг от друга бумажные диски, содержащие определенные дозы разных антибиотиков. Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня. По диаметру зон задержки роста исследуемой культуры бактерий судят о ее чув­ствительности к антибиотикам.

Для получения достоверных результатов необходимо приме­нять стандартные диски и питательные среды, для контроля которых используются эталонные штаммы соответствующих микроорганизмов. Метод дисков не дает надежных данных при определении чувствительности микроорганизмов к плохо диффундирующим в агар полипептидным антибиотикам (например, полимиксин, ристомицин). Если эти антибиотики предполагается использовать для лечения, рекомендуется определять чувстви­тельность микроорганизмов методом серийных разведений.

Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом серийных разведений. Данным методом определяют минимальную концентрацию антибиотика, ингибирующую рост исследуемой культуры бактерий. Вначале готовят основной раствор, содержащий определенную концентрацию антибиотика (мкг/мл или ЕД/мл) в специальном растворителе или буферном растворе. Из него готовят все последующие разведения в буль­оне (в объеме 1 мл), после чего к каждому разведению добав­ляют 0,1 мл исследуемой бактериальной суспензии, содержащей 10⁶—10⁷ бактериальных клеток в 1 мл. В последнюю пробирку вносят 1 мл бульона и 0,1 мл суспензии бактерий (контроль культуры). Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта по помутнению питатель­ной среды, сравнивая с контролем культуры. Последняя про­бирка с прозрачной питательной средой указывает на задержку роста исследуемой культуры бактерий, под влиянием содержа­щейся в ней минимальной ингибирующей концентрации (МИК) антибиотика.

Оценку результатов определения чувствительности микро­организмов к антибиотикам проводят по специальной готовой таблице, которая содержит пограничные значения диаметров зон задержки роста для устойчивых, умеренно устойчивых и чувствительных штам­мов, а также значения МИК антибиотиков для устойчивых и чувствительных штаммов.

К чувствительным относятся штаммы микроорганизмов, рост которых подавляется при концентрациях препарата, обнаружи­ваемых в сыворотке крови больного при использовании обычных доз антибиотиков.  К умеренно устойчивым относятся штаммы, для подавления роста которых требуются концентрации, созда­ющиеся в сыворотке крови при введении максимальных доз препарата. Устойчивыми являются микроорганизмы, рост кото­рых не подавляется препаратом в концентрациях, создаваемых в организме при использовании максимально допустимых доз.

Определение антибиотика в крови, моче и других жидкостях организма человека. В штатив устанавливают два ряда проби­рок. В одном из них готовят разведения эталонного антибиотика, в другом — исследуемой жидкости.  Затем  в  каждую  пробирку вносят   взвесь   тест-бактерий,   приготовленную   в  среде   Гисса с глюкозой. При определении в исследуемой жидкости пенициллина,   тетрациклинов,   эритромицина   в   качестве  тест-бактерий используют стандартный  штамм   S. aureus,  а  при  определении стрептомицина — Е. coli. После инкубирования посевов при 37 °С в течение 18—20 ч отмечают результаты опыта по помутнению среды и ее окрашиванию индикатором вследствие расщепления глюкозы   тест-бактериями.   Концентрация   антибиотика   опреде­ляется умножением наибольшего разведения исследуемой жид­кости,   задерживающей   рост   тест-бактерий,   на   минимальную концентрацию   эталонного  антибиотика,   задерживающего   рост тех же тест-бактерий. Например, если максимальное разведение исследуемой жидкости, задерживающее рост тест-бактерий, рав­но  1:1024,  а   минимальная  концентрация  эталонного  антибио­тика, задерживающего рост тех же тест-бактерий, 0,313 мкг/мл, то произведение   1024х0,313=320 мкг/мл  составляет  концен­трацию антибиотика в 1 мл.

Определение способности S. aureus продуцировать бета-лактамазу. В колбу с 0,5 мл суточной бульонной культуры стандарт­ного штамма стафилококка, чувствительного к пенициллину, вносят 20 мл расплавленного и охлажденного до 45 °С питатель­ного агара, перемешивают и выливают в чашку Петри. После застывания агара в центр чашки на поверхность среды поме­щают диск, содержащий пенициллин. По радиусам диска петлей засевают исследуемые культуры. Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта. О способности исследуемых бактерий продуцировать бета-лактамазу судят по наличию роста стандартного штамма стафило­кокка вокруг той или другой исследуемой культуры (вокруг диска).