Ферменты

I - гексокиназа; II - глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа; III - 6-фосфоглюконатдегидрогеназа; IV - рибулоза-5-фосфат-эпимераза; V - фосфокетолаза

Рисунок 4 - Последовательность реакций гетероферментативного молочного брожения

Многие молочнокислые бактерии, как гомо- ,так и гетероферментативные виды могут сбраживать не только гексозы, но и пентозы, которые превращаются в D-ксилулозо-5-фосфат, при участии ключевого фермента гетероферментативного брожения, расщепляющегося на ацетилфосфат и 3-фосфоглицериновый альдегид, а в конечном итоге дающие молочную и уксусную кислоты.

Продукты сбраживания фруктозы гетероферментативными лактобактериями – молочная кислота, уксусная кислота, маннит и СО₂.

Гомоферментативные представители лактококков и гетероферментативные – лейконостоков ферментируют лимонную кислоту, образуя, помимо других продуктов, диацетил – ароматическое вещество с запахом сливочного масла.

Суммарное уравнение процесса:

3-цитрат  лактат + 3 ацетат + 5СО₂ + диацетил

В процессе участвуют ферменты: цитрат-лиаза; оксалоацетатдекарбоксилаза; пируватдегидрогеназный комплекс; лактатдегидрогеназа; диацетилсинтаза и др. Ключевым ферментом брожения является цитрат-лиаза, при этом цитрат распадается на ацетат и оксалоацетат. Ацетат выделяется во внешнюю среду, оксалоацетат декарбоксилируется с образованием пирувата. Диацетил, восстанавливаемый ацетоиндегидрогеназой, превращается в ацетоин:

Выделение, культивирование и хранение молочнокислых бактерий

Ограниченные синтетические возможности молочнокислых бактерий вызваны неспособностью синтезировать ряд веществ, необходимых для жизнедеятельности. Все эти организмы обнаруживают сложные потребности в факторах роста: витаминах, особенно группы В, в значительном числе аминокислот. Питательные потребности создают трудности при их выделении и особенно количественном учете в различных природных и производственных субстратах. Многие представители молочнокислых бактерий растут очень медленно, " заглушаясь" сопутствующими микроорганизмами. Даже при выращивании на очень богатых средах колонии молочнокислых бактерий остаются всегда сравнительно небольшими (в среднем 1-2 мкм в диаметре). Их небольшой размер главным образом объясняется низким экономическим коэффициентом роста, что в свою очередь обусловлено бродильным типом метаболизма.

Для выделения молочнокислых бактерий используют среды, в должной степени обеспечивающие их питательные потребности и угнетающие рост посторонней микрофлоры. Последнее достигается включением в среду различных веществ – азида натрия, ацетата талия, сорбиновой и уксусной кислоты, этилового спирта, а также снижением рН среды. Выделение лактобактерий, особенно из субстратов, учет и культивирование наиболее успешно осуществляют на среде МРС следующего состава, %: глюкоза – 2,0; дрожжевой экстракт –0,5; мясной экстракт – 1,0; пептон – 1,0; лимоннокислый аммоний – 0,2; уксуснокислый натрий – 0,5; твин 80 – 0,1; K₂HPO₄ – 0,2; MgSO₄7H₂O – 0,02; MnSO₄4H₂O – 0,05; pH – 6,2-6,6, среду готовят на молоке в модификации по Богданову (обезжиренное), его добавляют не менее 500 мл на л, предварительно разведенное в два раза дистиллированной водой. Используют и среду МСР-1, где в отличие от предыдущей на 1 л среды добавляют 0,2 г цистеина, 50 мл дрожжевого автолизата и 100 мл печеночного экстракта.

Можно выделять и на среде следующего состава, %: растительный (капустный, морковный, томатный) отвар - 10,0; дрожжевой автолизат - 1,0; пептон -1,0; глюкоза - 2,0; этанол - 8,0-16,0. Спирт рекомендуют вносить в 18-24 часовую культуру, доращивая в дальнейшем 20-24 часа. Производя высев культуры из жидкой среды на агаризованную того же состава добавляют 4% измельченного мела. При росте на такой среде молочнокислые бактерии образуют вокруг колоний зоны просветления (превращение нераcтворимого CaCO₃ в растворимый лактат Ca). Известны и другие среды, например, Рогозы, Гибсона и Абд-эль-Малека, Дейвиса и т.д. Выделение некоторых лактобактерий следует проводить в атмосфере, содержащей 90% Н₂ и 10% СО₂.

Для длительного хранения молочнокислые бакетрии замораживают при температуре жидкого азота; при посеве уколом в столбик полужидкой среды, содержащей не более 0,25% глюкозы или 8-12% этанола.