Методы биотехнологии

На первых этапах развития науки биотехнологии пользовались живыми системами в той форме, в какой они существовали в природе – способ спонтанного применения бактерий, дрожжей и т.д.

Несколько позже стали использовать традиционные методы селекции или искусственного отбора микроорганизмов, растений, животных, получение более продуктивных штаммов, линий.

Проведение работ по расшифровке нуклеотидных последовательностей (секвенирование), дающих информацию о первичной структуре участков генома, выполняющих определенные функции, а также, увеличение разрешающей способности электронных микроскопов, позволяющих увидеть макромолекулы ДНК и РНК, и открытие ферментов рестрикции и лигирования привело к становлению и развитию генной инженерии. Структура и функция приобрели молекулярно-биологическое выражение, суть которого в том, что функциональные состояния выражают структурные изменения макромолекул и их ассоциаций. От изучения функционирования в клетке имеющегося в ней генетического материала, исследователи перешли к генетическим манипуляциям, используя два подхода - введение в клетки чужеродных генов и фузия (слияние) клеток, при которой клетки обмениваются генетической информацией, а в результате получаются гибридные клетки.

Генная инженерия – это конструирование in vitro функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК) и наследственно измененных организмов. Возможны три направления – введение генов в клетки бактерий и дрожжей, в соматические клетки (растений, животных, человека) зародышевые клетки.

Возникновение генной инженерии условно относят к 1972 году – когда создана первая рекомбинантная молекула ДНК (п.Берг и др., США). Для того, чтобы изменить наследственность организма методами генной инженерии, необходимо построить искусственные генетические структуры - рекомбинантные молекулы ДНК. Для этого необходимо получить фрагменты ДНК-гены, включить эти фрагменты в материальную ДНК-хромосому, введения гибридной ДНК, содержащей интересующие гены, в клетку, включения внесенных генов в генетический аппарат клетки, фиксирование в ней. В некоторых случаях производят исключение из клетки отдельных генов. Гены для клонирования могут быть получены с помощью химико-ферментного синтеза, непосредственно выделены из генома донорских клеток или путем клонирования информационных РНК. Инструментами в генно-инженерных исследованиях служат в основном два типа ферментов: рестриктирующие эндонуклеазы (рестриктазы), необходимые для выделения из донорской клетки гена, несущего определенную функциональную информацию; лигазы, соединяющие и сшивающие липкие концы нуклеотидов. Открытие этих ферментов в 1967-68 гг. привело к необыкновенному расширению экспериментальных возможностей биологии, позволило проникнуть в глубь явлений.

Большое значение имела и разработка способов внедрения гена в какую-либо живую систему, позволяющую ему быстро реплицироваться (размножаться). Инструментом для переноса чужеродной генетической информации служат плазмиды, вирусы и бактериофаги. Они могут использоваться в генной инженерии в качестве векторов. Векторы – это молекулы ДНК, способные переносить в клетку чужеродную ДНК, обеспечивать там ее размножение или включение в геном. Векторы должны размножаться в клетке-хозяине, иметь маркеры, обеспечивающие обнаружение трансформированных клеток, при введении чужеродной ДНК функции клеток не должны существенно нарушаться. В начале исследований векторные молекулы использовали только для введения в клетки бактерий. Информация, определяемая встроенным геном, позволяет клетке синтезировать новые для нее вещества. Клетки с нужными свойствами можно выделить из общей массы традиционным методом искусственного отбора.

Развитие генной инженерии вызвало ряд крупных научных открытий в молекулярной генетике. Например, обнаружение подвижных генетических элементов у эукариотических клеток. Они рассеяны в геноме, меняют свое положение в хромосомах, влияют на функцию генома. В 70-х годах это явление было установлено у бактерий. Подвижные гены названы мобильными диспергированными генетическими элементами – транспозонами, они могут инактивировать гены, расположенные рядом с ними. Их действие контролируется генетически.

Установлена мозаичная структура большинства эукариотных генов, состоящих из кодирующих белок участков (экзонов) и промежуточных (интронов), прямого отношения к синтезу белка не имеющих. Такая структура имеет отношение к процессингу и-РНК.

У бактерий интронов нет, поэтому в рекомбинантных молекулах эукариотный белок не синтезировался. Выход был найден с помощью использования ревертаз-ферментов, ответственных за обратную транскрипцию. Установлено, что на основе матричной РНК с помощью ревертазы можно получить ДНК-копию, не имеющую характерных для эукариот интронов. Не смотря на то, что в ней будут закодированы белки, свойственные эукариотам, копия будет похожа на бактериальную. В таком виде ее можно встроить в геном клетки-хозяина и на ней будет синтезирована и-РНК, а затем нужный белок. В настоящее время созданы штаммы бактерий, успешно метаболизирующие со вставленным в них фрагментом ДНК, полученным из растений, животных, человека или синтезированным ферментативным или химическим способами. Бактерии приобретают способность синтезировать белки специфичные для высших растений, животных, человека.

Техника будущего – направленное изменение структуры белков – белковая инженерия. Это – средство изучения структурно-функциональных взаимоотношений различных участков белковой молекулы. Белковая инженерия позволяет улучшать функционирование белков, конструировать новые белки. Например, повысить активность и устойчивость ферментов для нужд промышленности, создавать биосенсоры и биоэлементы для ЭВМ, переконструировать белки для улучшения их биоактивности (белковая терапия), получить новые репрессоры и рестриктазы для генной инженерии.

Одна из наиболее широко используемых в практике областей генной инженерии – конструирование микроорганизмов - продуцентов нужных веществ (суперпродуцентов аминокислот, витаминов, ферментов, нуклеотидов), деструкторов нефти, пластмасс, нафталина, фиксирующих азот. Наиболее эффективное в этом случае комплексное использование мутагенеза, селекции, методов рекомбинантных ДНК.

Важнейшее направление новейшей биотехнологии – клеточная инженерия. Она возникла в конце 60-х – начале 70-х годов на базе метода культур клеток и тканей, изолированных протопластов растений, а также микроклональное размножение растений, основанное на способности соматической клетки растений дать начало целому растению. Микроклональное размножение растений позволит в 3-4 раза ускорить сроки размножения многолетних растений, облегчить размножение элитных растений и новых безвирусных сортов.

Клеточная технология дает возможность усовершенствовать и ускорить селекционный процесс. Гибридизация соматических клеток, мутагенез, клеточная селекция в сочетании с генной инженерией – новые подходы, вносящие принципиальные изменения в селекционный процесс. Соматической гибридизацией – слиянием лишенных оболочки соматических клеток или их частей – можно преодолеть физиологическую несовместимость неродственных видов. Так как для этого метода не требуется знаний молекулярных основ действия генов, он имеет некоторое преимущество по сравнению с переносом генов.

Необходимо исследовать возможность получения искусственных ассоциаций межклеточного и внутриклеточного типа, в которые наряду с высшими растениями входят микроорганизмы, что приведет к повышению продуктивности растений, автономной фиксации или азота.

Для генетических манипуляций перспективно также клональное размножение животных клеток Важное направление клеточной инженерии связано с ранними эмбриональными стадиями. В животноводстве применяется манипуляция на клетках раннего эмбриона для получения монозиготных близнецов. Соединение клеток эмбрионов различных животных позволяет преодолеть межвидовой барьер, создавая химерических животных (овце-козлиные химеры). Перспективное направление – пересадка соматических ядер в зрелые яйцеклетки, что позволит клонировать животных, получая их с точно одинаковыми генетическими свойствами.

К важному направлению клеточной инженерии относится и создание гибридных клеток – гибридом для получения моноклональных антител. Внедрение генной и клеточной инженерии позволяет решать важнейшие проблемы диагностики и терапии рака, вирусных, наследственных и других заболеваний, производства пищи и т.д. Вместе с тем начали высказываться опасения, что использование метода может нанести вред человеку и среде, в которой он обитает. Часто возникают призывы к проведению научной оценки опасности, разработке мер безопасности. Ряд ученых считает, что методами генной инженерии можно получить культуры с непредсказуемой наследственностью, появлению высоко вирулентных форм микроорганизмов, по отношению к которым у человечества не существует никаких природных защитных систем. Микроорганизмы, полученные с помощью подобного метода, размножаясь, смогут нарушить экологическое равновесие.

Опасения вызывают и генетические манипуляции над животными и особенно человеком, обсуждаются связанные с этим этические проблемы.