Метод иммуноферментного анализа (ифа).

ИФА – метод определения антител (качественно и количественно) или антигена в сыворотке крови. Применяется твердофазный ИФА, в качестве твердой фазы используются планшеты или шарики с адсорбированными на них антигенами или антителами. Для определения антител в лунки планшета с адсорбированным известным антигеном добавляют исследуемую сыворотку. Если в сыворотке есть антитела, то образуются соединения антиген-антитело, несвязанные антитела удаляются промыванием. К полученным иммунным соединениям добавляют антииммуноглобулиновые антитела, меченные ферментом (пероксидаза), затем субстрат для фермента (перекись водорода) и хромоген. Полученный продукт имеет специфическую окраску, наличие и интенсивность которой определяют объективно в цифрах с помощью специального прибора.

Против возбудителей вырабатываются и циркулируют в крови специфические антитела. При первичной инфекции вначале появляются антитела класса Ig М, затем Ig G и Ig А. Антитела Ig G появляются позже и их титр нарастает одновременно с падением титра антител Ig М (сероконверсия). Диагностика сероконверсии принципиально важна для беременных, когда решается вопрос о первичной вирусной (герпес, цитомегалия, краснуха), токсоплазменной инфекции. Для этого применяют метод парных сывороток. При хронической инфекции титр антител Ig М может оставаться одинаково низким, а титр Ig G нарастает. После перенесенной инфекции антитела долго циркулируют в крови, а антитела Ig G остаются пожизненно.

Наличие в крови специфических антител Ig G свидетельствует о перенесенной в прошлом инфекции или текущей в настоящее время хронической инфекции.

Преимущества ИФА:

- возможность серийных (партиями) постановок;

- метод автомотизирован, результаты документируются;

- использование метода для массовых скринингов;

- диагностика сероконверсии (при первичной инфекции);

- диагностика инфекции любой локализации, когда недоступен биоматериал, содержащий антиген или ДНК.

Недостатки ИФА:

- необходимость определения двух классов антител в динамике;

- ложно отрицательный результат в ранние сроки после инфицирования, когда нет антител в достаточном количестве;

- низкая информативность для контроля излеченности, так как антитела длительно циркулируют в крови.

Приложение 6

Метод иммунофлюоресценции (иф).

Этот метод выполняется с использованием люминесцентной микроскопии. Относительно свечения микроскопических объектов в литературе используют термины «люминесценция» и «флюоресценция» как однозначные. Вторичная (наведенная) люминесценция достигается путем обработки исследуемого материала химическим красителем (флюорохромом). В зависимости от применяемого красителя и его концентрации достигается свечение объекта от желто-зеленого до красно-оранжевого. Люминесцентная микроскопия выполняется с иммерсионным нефлюоресцирующим маслом.

ИФ используется для диагностики антигена возбудителя в биологическом материале, в котором содержится возбудитель. Для выявления антигенов микоплазм, уреаплазм, хламидий материал для исследования является соскоб эпителия слизистой оболочки уретры, цервикального канала. Исследуемый материал, содержащий антиген, наносится на предметное стекло, фиксируется спиртом и обрабатывается гомологичной сывороткой, меченой флюорохромом. При связывании антигена с антителом появляется яркое свечение, обнаруживаемое с помощью люминесцентной микроскопии.

В зависимости от способа окраски различают прямой и непрямой методы ИФ. Прямой метод ИФ: на препарат наносится люминесцирующая сыворотка, после соединения с антигенами меченные флюорохромом антитела дают свечение. Непрямой метод ИФ проводится в два этапа. Первый этап: на препарат наносится нефлюоресцирующая гомологичная сыворотка, комплексы антиген-антитело не флюоресцируют. Второй этап: на препарат наносится флюоресцирующая сыворотка против полученных комплексов антиген-антитело.

Преимущества ИФ:

- выполняются единичные исследования;

- простота и высокая скорость выполнения;

- возможность применения для скрининга, экспресс-диагностики;

- можно применять для исследования микропрепаратов из парафиновых блоков для диагностики внутриутробных инфекций.

Недостатки ИФ:

- низкая чувствительность и специфичность;

- субъективность в оценке мазка;

- невозможность документирования;

- точность диагностики зависит от качества взятия материала (обязательны клетки цилиндрического эпителия);

- низкая информативность для контроля излеченности, так как флюоресцируют антигены нежизнеспособных микроорганизмов.

Приложение 7