Техніка приготування фіксованих препаратів мікроорганізмів

При фіксації клітини м/о гинуть. При цьому зберігається незмінною їх структура. А при наступному забарвленні та мікроскопуванні препарату можна дослідити морфологію та будову клітин. Для забарвлення м/о використовуються основні, кислі або нейтральні барвники. Зокрема, найбільше застосування мають основні фарби: метиленовий синій, лужний фуксин, кристалічний фіолетовий та ін. Для забарвлення препаратів готують спиртові, водно-спиртові і водні розчини; у деяких випадках додають у якості протрави карболову кислоту (фенол), луг та ін. Забарвлення м/о ґрунтується на явищі спорідненості між барвником і об'єктом. Основні барвники складаються з катіону, який забарвлюється і безколірного аніону. Оскільки бактерії володіють поверхнево-негативним зарядом і у них містяться сполуки кислої природи (нуклеїнові кислоти), основні барвники характеризуються більшою спорідненістю до клітин ніж кислі фарби, тому широко використовуються у мікробіології.

При мікроскопії у світлому полі фіксовані забарвлені препарати мають ряд переваг перед живими препаратами: висока контрастність, можливість вибіркового виявлення клітинних структур, безпека при роботі, тривалість зберігання препарату.

Приготування препарату включає наступні етапи: приготування мазка, висушування, фіксацію і забарвлення. Хід роботи

Приготування мазка. Мазок готують на предметному склі з допомогою петлі чи пастерівської піпетки з культурою мікробів, тканин, крові і т. д. На сухе і знежирене предметне скло вносять краплю дистильованої води чи фізіологічного розчину. Стерильною петлею беруть невелику кількість стерильної культури і вносять її у краплю води на предметнім склі до помутніння краплі, після чого розподіляють бактеріальну суспензію тонким шаром петлею по поверхні предметного скла. При роботі з культурою бактерій, яка виросла на рідкому середовищі на скло вносять тільки краплю мікробної суспензії.

Висушування і фіксація. Мазок висушують на повітрі чи у струмені теплого повітря над полум'ям, тримаючи скло мазком доверху. Після цього охолоджений мазок фіксують у полум'ї спиртівки: скло з мазком, повернути догори, і провести 3-4 рази крізь полум’я спиртівки. При цьому мікроби гинуть, мазок прикріплюється до скла. Можлива також фіксація хімічним шляхом за допомогою етилового чи метилового спиртів, сумішшю рівних об'ємів спирту з ефіром та ін.

Забарвлення препарату може бути простим і складним.

При простих методах забарвлення використовують одну фарбу (фуксин чи метиленовий синій). На охолоджений фіксований мазок вносять розчин барвника фуксину чи метиленового синього. Фуксин забарвлює протягом 1-2 хв, інтенсивно і однаково всі види бактерій, Метиленовий синій забарвлює повільніше (3-5 хв), менш яскраво, але препарати виходять більш чіткі.

При складних методах використовують дві і більше фарб (фарбування методом за Грамом, Цілем-Нільсеном, Нейсером, Ожешко, Бурі-Гінса, Романовського-Гімзи).

Фарбування бактерій за методом Грама

Метод фарбування бактерій був запропонований датським вченим Х. Грамом у 1884 р. Він ґрунтується на відмінностях у хімічному складі клітинних оболонок мікроорганізмів. Суть його полягає в тому, що у одних видів мікроорганізмів у клітині утворюється комплекс йоду і барвника кристалічного (генціану) фіолетового, який не вимивається спиртом, а у інших видів цей комплекс вимивається з клітини спиртом. Бактерії першої групи називають грампозитивними, а другої – грамнегативними. Останні для виявлення потребують додаткового фарбування. Відношення бактерій до фарбування за Грамом використовується як одна з таксономічних ознак при вивченні виду. Фарбування за Грамом є важливою таксономічною ознакою, з якою пов’язані й багато інших характеристик бактерій.

Слід пам’ятати, що на здатність фарбуватись чи ні за методом Грама впливає не тільки вид мікроорганізмів, а й такі фактори, як склад середовища культивування, фаза росту мікроорганізмів, ступінь їх життєздатності. Так, в старих культурах мертві клітини завжди фарбуються як грамнегативні. Деякі коринебактерії, протей можуть фарбуватися варіабельно, тобто частина клітин – як грампозитивні, а частина – як грамнегативні.