Лабораторна робота №10. Вивчення роботи фотоелектроколориметра.

Мета. Навчитись користуватись фотоелектроколориметром, визначити спектри поглинання та пропускання заданого розчину.

Теоретичний вступ

Світловий промінь ─ це високочастотна електромагнітна хвиля, яка поширюється у повітрі зі швидкістю 300 000 км/с . Вона несе енергію порціями або квантами. Видиме людським оком світло має довжини хвиль від 400 до 750 нм. Світло з меншою довжиною хвилі називається ультрафіолетовим, з більшою ─ інфрачервоним. Біле світло складається з набору хвиль різної довжини, що підтверджується розкладом його у спектр за допомогою призми. Різнокольорова веселка у небі після дощу також виникає внаслідок розкладу у спектр сонячних променів краплинами води атмосфери. Спектр умовно поділяють на сім кольорів. Найбільшу довжину хвилі, а отже, найменшу енергію має червоне світло, найменшу довжину хвилі, а отже, найбільшу енергію має фіолетове. При проходженні білого світла крізь речовину одні довжини хвиль поглинаються сильніше, інші ─ слабше або не поглинаються взагалі. Тому прозорі речовини, в тому числі і розчини, при спостереженні на просвіт мають певний колір. Якщо, наприклад, розчин має жовтий колір, то це може означати, що він найменше поглинає світло саме цього кольору. По цій же причині різні предмети мають свої кольори і в відбитому світлі. Разом з тим, колір предмету чи розчину може виявитись сумішшю різних кольорів, наприклад, зелений колір може бути сумішшю жовтого і синього.

Поглинання світла відбувається на молекулярному рівні. Кожна молекула має власну систему електронних (енергетичних) рівнів. На кожному рівні може знаходитись тільки 2 електрони з протилежними спінами згідно принципу Паулі (спін ─ власний магнітний момент електрона). Навіть якщо електрони знаходяться на одній орбіталі, то їхні енергії повинні дещо відрізнятись. Таким чином відбувається розщеплення енергетичних рівнів молекули на підрівні.

Н айвищий заповнений рі­вень незбудженої молекули (основ­ний рівень) позначають S₀. Елект­рони на ньому мають протилежні спіни. Молекула в незбудженому стані знаходиться на одному з най­нижчих підрівнів основного рівня. При поглинанні кванта світла мо­лекула (вірні­ше, один із її електро­нів) переходить на один із збудже­них рівнів S₁, S₂ тощо (на один із його підрівнів). При цьому спін електрона не міняється, а його енергія зростає на величину, рівну різниці між енергіями рівнів, між якими відбувся електронний перехід. Ці рівні називаються синглетними. Необхідною умовою такого переходу є приблизна рівність енергії світлового кванта і різниці енергій між електронними рівнями. Саме це є причиною того, що різні речовини поглинають різні довжини хвиль. Практи­чно відразу ж після збудження молекула переходить на най­нижчий підрівень збудженого рівня. Час життя молекули у збудженому синглетному стані S₁ – 10^–8–10^–9 с. Після цього з певними ймо­вірностями можуть відбуватись такі перетворення енергії:

1. в тепло з переходом на основний рівень (на один із його підрівнів);

2. випромінювання кванта флуоресценції з переходом на основний рівень (на один із його під­рівнів) ─ саме внаслідок цього ми і спостерігаємо світло певного кольору при відбиванні від предмета або проходженні крізь нього;

3. фотохімічна реакція;

4. передача енергії збудження іншій молекулі;

5. зміна спіну збудженого електрона й перехід молекули у триплетний стан T₁.

Перехід з триплетного стану в основний заборонений, оскільки спіни електронів однакові. Тому в триплетному стані молекула може знаходитись значно довше (від 10^–7 с до кількох годин). Повернутися в основний стан молекула може такими шляхами:

• з перетворенням енергії у тепло;

• випромінювання кванта фосфоресценції (перехід на один із підрівнів основного рівня);

• фотохімічна реакція;

• передача енергії збудження іншій молекулі.

Спільна назва флуоресценції й фосфоресценції – люмінесценція.

Спектр флуоресценції зсунутий у бік більших довжин хвиль по відношенню до найбільш довгохвильового максимуму поглина­ння – правило Стокса (це видно зі схеми електронних рівнів, оскільки при поглинанні кванта світла електрон переходить на будь-який підрівень синглетного стану, а повертається в основний стан тільки з найнижчого підрівня, тому енергія кванта флуоресценції менша, ніж поглинутого кванта).

Чим більший шлях проходить світловий промінь у розчині та чим більша концентрація розчину, тим сильніше він поглинається. Ступінь поглинання визначає оптична густина розчину ─ це величина, яка показує, наскільки зменшується інтенсивність променя при проходженні через цей розчин:

ε ─ молярний коефіцієнт поглинання (екстинкції), [ε]=л/(моль·см),

α ─ коефіцієнт поглинання розчину з заданою концентрацією, 1/м,

─ інтенсивність падаючого променя,

─ інтенсивність променя на виході з розчину,

n ─ концентрація розчину в моль/л,

l ─ довжина кювети з розчином.

Коефіцієнт поглинання ─ оптична густина одиниці довжини розчину. Його можна обчислити за формулою . Величина, обернена до нього, називається довжиною екстинкції ─ це відстань, при проходженні якої інтенсивність променя зменшується в е≈2,7 разів.

Якщо замінити lg на ln і концентрацію виразити в см^–3, то замість ε використовують ефективний поперечний переріз поглинання σ, [σ]=см² (у якому фотон певної дов­жини хвилі поглинається).

Залежність D, ε або σ від λ – спектр поглинання. Оберненою величиною до оптичної густини є коефіцієнт пропускання . Спектри поглинання й спектри пропу­скання вимірюють спектрофотометром або фотоколориметром. У фотоколориметр необхідно вставити дві кювети: одну з досліджуваним розчином, а другу ─ з чистим розчинником для порівняння. За допомогою спектрів поглинання роблять кількісну оцінку вмісту поглинаючої світло речовини у досліджуваному зразку. Це можна робити також і за спектрами відбивання. Так оцінюють вміст гемоглобіну у шкірі. Падаюче на шкіру монохро­матичне світло ослаблюється за рахунок поглинання, частина світла після багатократного роз­сіювання клітинами шкіри виходить назовні (відбивається). При еритемі, коли різко зростає мі­кроциркуляція і підвищується вміст гемоглобіну в шкірі, відбиваюча здатність шкіри на хвилях 540 і 578 нм (зелене і жовте світло) різко зменшується.

Спектр поглинання білка в УФ області визначається поглинанням ароматичних аміно­кислот – триптофану, тирозину, фенілаланіну. Максимум поглинання розчинів білків та амінокислот знаходиться в межах 260─280 нм. При конформаційних перебудовах білкових молекул зміщення спектра мале (<0,1 нм) і його важко реєструвати, тому використовується диференціальна спектрофотометрія. Диферен­ціальний спектр – різниця між спектрами поглинання досліджуваної речовини і відомої.

Методи абсорбційної й диференціальної спектрофотометрії використовуються для ви­значення констант рівноваги дисоціації низькомолекулярних лігандів, констант швидкості асо­ціації субодиниць у білках, конформаційних змін у білках тощо.

Флуоресцентна спектроскопія білків використовується для вивчення конформаційних станів білків у розчині.