Семинар № 12 Тема «Хранение спермы. Технология замораживания»

Цель занятия: изучить состав основных сред для разбавления спермы, методы их приготовления и применения для хранения при различных температурных режимах

Материалы и оборудование: сперма животных, колбы, измерительные цилиндры, микроскопы, пинцеты, скальпели, фильтровальная бумага, водяная баня, дистиллированная вода, компоненты сред.

Длительное хранение спермы

Наиболее значительным достижением в области искусственного осеменения явилась разработка мето­да глубокого замораживания и длительного хранения спермы.

В 1964 г. японские ученые X. Нагазе и Т. Нива разработали оригинальный метод замораживания спермы быков в необлицованных гранулах на блоках твердой двуокиси углерода. Ввиду исключительной простоты способ быстро приобрел популярность во многих странах мира. В РФ около 50% спермы бы­ков еще замораживают по данной технологии с той лишь разницей, что вместо сухого льда применяют фторопластовую пластину, охлаждаемую жидким азотом. Свежеполученный эякулят разбавляют двухмоментно лактозо-глицерин-желточной средой в со­отношении 1:2 — 1:6, затем переносят в бытовой холодильник (температура 4—5°С) на 3—4 ч. Этого времени достаточно для проникновения глицерина внутрь спермиев.

Для замораживания спермы в гранулах приме­няют термоизоляционный сосуд из нержавеющей ста­ли размером 30 х 40 х 30 см и фторопластовую плас­тину с лунками. В сосуд заливают жидкий азот, на дно опускают фторопластовую пластину и охлаждают несколько минут, до прекращения' бурного кипения. Затем ее поднимают на 0,5 см выше уровня жидкого азота.

После испарения с пластины жидкого азота по­верхность ее протирают стерильной марлевой салфет­кой. С помощью полиэтиленовой капельницы или шприца с инъекционной иглой охлажденную сперму накапывают в лунки по 0,15—0,2 мл. После того как гранулы затвердеют, пластину еще 1—2 мин выдержи­вают в парах жидкого азота с последующим погруже­нием пластины с гранулами на 1 мин в жидкий азот, что обеспечивает отделение гранул. Гранулы собирают с поддона и ссыпают в пенал или марлевый мешочек. Перед закладкой на хранение 1—2 гранулы размора­живают и оценивают по подвижности; она должна быть не ниже 4 баллов.

Более чем 30-летний опыт применения в нашей стране описанного способа показывает, что наряду с несомненными достоинствами он не лишен недостат­ков: большая доля низкопроизводительного ручно­го труда при осуществлении основных техно­логических операций; прямой контакт с хладагентом (жидкий азот), что приводит к адсорбции на поверхности гра­нул микроорганизмов и механических приме­сей; во время заправки сосудов Дьюара и стацио­нарных хранилищ жидким азотом возможен механический перенос спермиев и микроорга­низмов от гранулы к грануле. По методике Ф.И. Осташко на Украине замора­живают сперму в облицованных гранулах. Разбавлен­ной спермой заполняют тонкую полимерную трубку; с помощью автоматического устройства ее делят на спермодозы с одновременной герметизацией и марки­ровкой. Загерметизированные гранулы упаковывают в тубы, последние закрепляют на дисках, для эквилибрации и последующего замораживания погружением диска с тубами в жидкий азот на 10—12 мин.

В 1975 г. Р. Кассу (Франция) для расфасовки спермы быков впервые применил соломинки из поли­пропилена (пайеты) емкостью 0,5 мл.

Замораживают сперму по французской техноло­гии в такой последовательности. Свежеполученную сперму разбавляют средой «Лецифос-271» с внесени­ем 10% желтка куриных яиц или «Лецифос-Плас-470», все компоненты которой находятся в сублими­рованном состоянии. Затем под вакуумом ее расфасо­вывают в соломинки, концы которых герметизируют поливиниловым спиртом или термосваркой. В даль­нейшем соломинки маркируют, выдерживают 2 ч в воде, охлажденной до 5°С, замораживают в парах жидкого азота.

Эта методика наиболее перспективна. Она позво­ляет достичь высокой степени асептизации, механиза­ции и автоматизации на всех этапах технологической обработки спермы, перевести замораживание спермы ^на промышленную основу. Криоконсервация спермы в "Пакетах устраняет недостатки в технологии, присущие изготовлению как неооблицованных, так и облицован­ных гранул.

Дальнейшее совершенствование способа привело к разработке техних:и замораживания спермы в мини-пайетах (объем 0,25 мл), что повысило эффективность, использования высокоценных быков, позволило заго­тавливать от них 30—40 тыс. спермодоз в год.

Криоконсервирование спермы хряков

Разработка практически приемлемого способа за­мораживания спермы хряков сопряжена с большими специфическими трудностями: большие объемы спер­мы, повышенная чувствительность к низким темпера­турам, особенности метаболизма.

По отечественной технологии, предложенной В.К. Миловановым, для разбавления используют как цельный эякулят, так и густую фракцию спермы или центрифугат. Свежеполученную сперму выдерживают 1 ч при температуре 15—26 °С, разбавляют в соотноше­нии 1:1 трис-Ыа-ЭДТА-средой.

Из разбавленной спермы отсасывают воздух ва­куумным способом, насыщают водородом, выдержива­ют 3 ч в анаэробных условиях при 1б-18°С, переносят на 1 ч в холодильник с температурой 5 °С, затем на 30 мин — в ледяную воду. Замораживают на охлаж­денной до — 100°С фторопластовой пластине, при этом получают гранулы объемом 0,5 мл.

При искусственном осеменении свиней заморо­женной спермой оплодотворяемость составляет около 50%, многоплодие — 8,4-11,7 поросенка. Несмотря на вполне удовлетворительные показатели оплодотво-ряемости и многоплодия, искусственное осеменение свиней замороженной спермой не получило широкого практического применения. Это объясняется громозд­костью технологии, большими потерями спермы в процессе технологической обработки (из эякулята уда­ется заготовить лишь одну спермодозу). На данном этапе ее применение экономически оправдано лишь в племенной работе, в частности, при создании нужных генотипов баз завоза в хозяйство хряков.

Криоконсервирование спермы баранов

Разработка приемлемого для практических це­лей способа замораживания спермы баранов стала воз­можной лишь после того, как были изучены особенно­сти метаболизма половых клеток.

В отличие от других видов сельскохозяйствен­ных животных, сперма барана не содержит природно­го антиоксиданта, который защищал бы спермин от супероксида 0₂Н, образующегося в процессе жизнеде­ятельности спермиев и являющегося весьма активным окислителем.

В связи с отмеченной особенностью, в процессе криообработки спермы барана происходит перекисное окисление липидов, что приводит к разрушению белково-липидных комплексов в мембранах половых кле­ток, повреждению акросомы. Введение в состав сред для спермы барана антиоксидантов (эхинохром, коламин, токоферол, ИХФГАН-3) не только предупрежда­ет отмеченные криогенные повреждения, но и повы­шает устойчивость спермиев к холодовому шоку.

В.К. Милованов для глубокого замораживания спермы барана предложил среду ВИЖ; в ее состав входят сахароза, ЭДТА, глицерин, желток куриных яиц, токоферол (или эхинохром), спермосан.

Е.М. Платов разработал рецепт лактозо-желточно-гуммиарабик-трис-цитратной (ЛЖГТЦ) среды; ее выпус­кают в виде сухих заготовок. Сперму барана разбавляют ЛЖТЦ-средой в 3—4 раза, эквилибрируют 2—3 ч при тем­пературе 2—4°С, замораживают на фторопластовой плас­тине при температуре —80...—90°С в виде гранул объемом 0,2 мл. При использовании такой спермы в производ­ственных условиях оплодотворяемость составила 42%.

Сперму жеребцов разбавляют лактозо-хелато-цит-ратно-желточной средой в 5 раз, расфасовывают в по­липропиленовые трубки емкостью 10 мл (их использу­ют и как часть осеменительного прибора). После 2-ча­совой эквилибрации замораживают в парах жидкого азота. При использовании замороженной этим способом спермы зажеребляемость составляет около 60%.