Лекция № 13 (2 часа) Тема «Теория и практика разбавления и хранения спермы»

1. Вопросы лекции

1. Общие требования, предъявляемые к разбавителям.

2. Компоненты сред для разбавления спермы.

3. Условия приготовления сред.

4. Оптимальная степень разбавления спермы.

5. Хранение спермы при комнатной температуре.

6. Хранение спермы при температуре 2-4°

7. Длительное хранение спермы в жидком азоте.

2 Литература

2.1 Основная

2.1.1 А.П. Студенцов, в.С. Шипилов, в.Я. Никитин, м.Г. Миролюбов.

Ветеринарное акушерство, гинекология и биотехника размножения./ Под ред. В. Я. Никитина, М.Г. Миролюбова. Учеб. для студ. высш. учеб. завед. -7 -е изд.. перераб. и дои. - М.: Колос, 2000. - 495 с.

2.1.2 В.Я. Никитин, М.Г. Миролюбов, В.П. ГончаровДЗ.В. Храмцов. Практикум по акушерству, гинекологии и биотехнике размножения животных. Учеб. и учеб пособие для студ. высш. учеб. завед. - М.: КолосС, 2004. - 208 с.

2.2 Дополнительная

2.2.1 Н.Н. Михайлов, Г.В. Паршутин, В.П. Гончаров и др. Акушерство, гине­кология и искусственное осеменение с.-х. животных. Под ред. Н.Н. Михайлова.-М: Агропромиздат, 1990.- 527с.

2.2.2 В.К. Пономарев. Ветеринарное акушерство и гинекология (цикл лекций). Учебное пособие для вузов. - Оренбург: Издательство «1МЕХТ», 1997. -176 с.

3. Краткое содержание вопросов

3.1. Разбавление спермы

Для разбавления спермы применяют синтетические и биологические среды.

Среды для разбавления и кратковременного хранения спермы быка при 2-4 ºС:

Хорошим разбавителем для спермы быка, жеребца, хряка и других производителей является свежее молоко. Молочный разбавитель повышает переживаемость спермиев, их оплодотворяющую способность, которая при температуре 0 ºС сохраняется до 7 суток.

Приготовление синтетических сред

Глюкозо-цитратно-желточная среда для спермы быка и барана

В чистую, стерильную химическую колбу наливают необходимый объем дистиллированной воды,

закрывают ее бумажным колпаком,

кипятят,

остужают до температуры 35 ºС,

на технохимических весах отвешивают согласно рецепту глюкозу и натрий лимоннокислый и высыпают их в другую колбу,

измерительным цилиндром отмеривают необходимое количество остуженной до 35 ºС дистиллированной воды и вливают ее в колбу с реактивами,

размешивают компоненты в воде до полного их растворения,

среду фильтруют и стерилизуют в водяной бане 5-10 минут с момента закипания воды,

охлаждают до 35 ºС ,

добавляют в нее спермосан-3 и желток свежих куриных яиц.

Приготовленную синтетическую среду помещают в термостат или водяную баню температурой 30-35 ºС и в теплом виде используют для разбавления спермы. Срок использования среды не должен превышать 3-4 часа с момента ее приготовления.

Молочно-желточная среда для спермы быка

берут свежевыдоенное молоко от здоровых коров ,

процеживают через два слоя стерильной марли в чистую стеклянную колбу,

ставят на нагревательный прибор,

доводят до кипения,

молоко вновь процеживают через стерильную марлю,

охлаждают до 30-35 ºС,

на каждые 100 мл среды добавляют по 20 мл желтка свежих куриных яиц.

Глюкозо-фосфатная среда для спермы барана

в чистую колбу согласно рецепту всыпают отвешенные натрий и калий фосфорнокислые, глюкозу,

отмеряют нужное количество дистиллированной воды и вливают в посуду с сухими веществами,

после растворения всех веществ колбу закрывают стерильным бумажным колпаком.

Используют среду в теплом виде для разбавления спермы.

Глюкозо-желточная и лактоза-желточная среды для спермы жеребца

согласно рецепту отвешивают глюкозу или лактозу,

высыпают в чистую стерильную колбу,

вливают необходимое количество дистиллированной воды,

фильтруют,

добавляют спермосан-3 и желток куриных яиц.

Молочно-желточная среда для спермы жеребца

берут свежевыдоенное молоко кобылы или коровы,

способ приготовления среды такой же, как и молочно-желточной среды для разбавления среды быка.

Глюкозо-хелато-цитратно-сульфатная (ГХЦС) и глюкозо-хелато-цитратная (ГХЦ) среды для разбавления спермы хряка

в чистую колбу наливают требуемый объем дистиллированной воды,

добавляют все компоненты согласно рецепту, за исключением, асептических веществ,

размешивают,

закрывают колбу бумажным колпаком,

кипятят 5-10 минут,

охлаждают до 35-40 ºС,

добавляют спермосан-3 в количестве 250-300 тыс.ед. на 1000 мл.

Глюкозо-солевой раствор для спермы хряка

в чистую колбу высыпают нужное количество глюкозы и натрия хлорида,

вливают необходимый объем остуженной до 35 ºС дистиллированной воды,

раствор размешивают и используют в теплом виде.

Техника разбавления спермы

Перед разбавлением температура сред и спермы должна быть одинаковой, во избежание температурного шока спермиев. Для этого посуду со средой нагревают в термостате или водяной бане до 30-35 ºС.

Сперму быка разбавляют в градуированном смесителе или мензурке. Сперму барана – в спермоприемнике или стерильном флаконе из-под антибиотиков, сперму жеребца или хряка – в стерильных колбах.

Для разбавления допускается сперма быка с активностью спермиев не ниже 8 баллов и концентрацией в 1 мл не менее 800 млн. спермиев. Сперму быка разбавляют в 10-20-50 раз и более. После разбавления в 1 мл разбавленной спермы быка должно содержаться не менее 15 млн. спермиев с активным прямолинейно-поступательным движением – 4 балла (40%).

Сперму барана разбавляют только густую с активностью спермиев не ниже 9 баллов. В зависимости от концентрации сперму барана разбавляют в 2-4 раза (1:1, 1:3) с концентрацией в дозе не менее 80 млн. спермиев с прямолинейно-поступательным движением.

Сперму хряка разбавляют средами при активности спермиев не ниже 8 баллов с содержанием в 1 мл не менее 100 млн. спермиев. Разбавляют сперму в 2-10 раз через 30-60 мин. После ее получения. Вначале сперму разбавляют 2-3 раза, а затем перед осеменением так, чтобы после разбавления в 1 мл ее содержалось не менее 30 млн. спермиев, а в дозе – не менее 3 млрд. спермиев.

Сперму жеребца допускают к разбавлению с оценкой не ниже 6 баллов с концентрацией не менее 150 млн. спермиев в 1 мл спермы. Разбавляют в 3-4 раза (1:2,1:3) с концентрацией в дозе не менее 3 млрд. спермиев. Сперму средой разбавляют постепенно. Для этого среду приливают к сперме небольшими порциями и осторожно смешивают. Разбавленную сперму обязательно проверяют под микроскопом на активность спермиев.

3.5. Хранение спермы

Существует несколько методов хранения спермы:

кратковременное – при плюсовых температурах для спермы быков, баранов, хряков и жеребцов;

длительное – в замороженном состоянии в жидком азоте для спермы быков и жеребцов.

Хранение спермы быка и барана при температуре плюс 2-4 ºС

разбавленную сперму разливают во флаконы;

выдерживают при комнатной температуре (18-25 ºС) в течение 20-30 минут (сперму барана – 10-15 минут);

емкости со спермой помещают в бытовой электрохолодильник или термос со льдом.

Для предотвращения температурного шока спермиев используют термоизолирующие приспособления (вату, поролон и пр.), чтобы сперма охладилась до 2-4 ºС в течение 3-4 часов.

В термосе должно быть не менее 1/3 емкости тающего льда.

Флаконы со спермой герметизируют в полиэтиленовых или резиновых упаковках.

По мере таяния льда талую воду из термоса сливают и добавляют лед.

При любом способе транспортировки не следует допускать:

сильного встряхивания и взбалтывания спермы;

полного использования льда;

повреждений термосов.

Сосуды со спермой должны быть промаркированы, к ним необходимо прилагать накладные (ордера) с соответствующей информацией.

Разбавленную сперму быка, сохраненную при 2-4 ºС, используют для искусственного осеменения коров и телок в течение 3 суток при активности спермиев не ниже 7 баллов, сперму барана используют в течение 2 суток, иногда 36 часов при активности спермиев не ниже 8 баллов.

Хранение спермы жеребца при температуре 2-4 ºС

разбавленную сперму фасуют в стерильные стеклянные баночки объемом 50-100 мл, закрываемые притертыми пробками;

помещают в полиэтиленовый мешочек;

кладут в термос со льдом.

Используют сперму для осеменения кобыл в течение 48 часов.

Хранение спермы при температуре 16-20 ºс

сперму разливают в стеклянные колбы или полиэтиленовые флаконы;

негерметично их прикрывают целлофаном или пергаментной бумагой;

хранят в темном месте при температуре 16-20 ºС.

Сперму используют для осеменения свиноматок в течение 3 суток с активностью спермиев не ниже 6 баллов.

Замораживание и длительное хранение спермы быка

Используется метод замораживания и длительного хранения спермы быков в жидком азоте при температуре – 196 ºС. В таком состоянии сперму можно хранить в течение многих месяцев или нескольких лет без потери оплодотворяющей способности. Используют для замораживания сперму с концентрацией спермиев не ниже 8 баллов.

Замораживание спермы в форме гранул на фторопластовых пластинках

перед разбавление среду подогревают до 30-35ºС;

этой средой сперму разбавляют в 2,10 раз и более, в зависимости от объема гранул;

охлаждают до температуры 2-4ºС в течение 4-5 часов;

разливают в лунки(0,1-0,2 или 0,5 мл) охлажденной в жидком азоте фторопластовой пластины;

пластину со спермой выдерживают над поверхностью жидкого азота на расстоянии 5-10 см в течении 1,5-2 минут;

погружают ее в жидкий азот на 1-2 минуты;

после замораживания спермы пластину вынимают из жидкого азота;

гранулы спермы собирают в сачок или контейнер.

Замораживание спермы в облицованных гранулах

По этому методу замораживания используют свежеполученную сперму, разбавленную средами №1 и №2. Разбавление производят с помощью специального устройства, позволяющего дозированно вводить среды в отдаленную часть одноразового полиэтиленового спермоприемника со спермой. Спермоприемник соединяют с тонкой полимерной трубкой диаметром 3,8 – 4,0 мм, с толщиной стенки 120 мкм и выдавливают в нее разбавленную сперму с помощью автомата ПРЖ на отдельные дозы по 0,25 – 0,33 мл и герметизируют путем термической сварки.

Активность спермиев после замораживания спермы проверяют через 24 часа. Для дальнейшего хранения допускают сперму с активностью не ниже 4 баллов.

Замораживание спермы в соломинках (пайеттах)

При замораживании используют полипропиленовые трубочки емкостью 0,25 мл. Для этого используют машину, которая автоматически наполняет спермой соломинки и закупоривает их с обоих концов стерильными шариками. Штативы с соломинками кладут в холодильник при температуре 4ºС на 3-4 часа. После охлаждения оценивают подвижность спермиев и для замораживания допускают сперму с оценкой не ниже 8 баллов. Для осеменения используют сперму не раньше 14-20 дней после замораживания. Оттаявшую сперму вновь замораживать нельзя.

Проверка активности замороженной спермы

Для проверки активности спермы, сохраненной при температуре 2-4 ºС:

открывают термос;

достают флакон;

осторожно перемешивают в нем сперму (путем вращения флакона);

берут каплю спермы на исследование;

флакон со спермой быстро помещают в термос со льдом.

Каплю спермы наносят на предметное стекло и рядом с ней каплю 2,9%-ного раствора натрия лимоннокислого, смешивают, накрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом при температуре 38-40 ºС.

Каплю спермы хряка, сохраненной при температуре 16-20 ºС , для оценки наносят на предметное стекло, добавляют к ней каплю 2,9 %-ного раствора натрия лимоннокислого, накрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом при температуре 40-42 ºС через 3-5 минут после нагревания.

Замороженную сперму быка оценивают после оттаивания. Замороженную сперму в гранулах (по 0,1-0,2 мл) помещают в теплый (38-40ºС) 2,9%-ный раствор натрия лимоннокислого объемом по 1 мл, после чего берут каплю для оценки. Исследуют сперму при температуре 38-40ºС.

Для оттаивания спермы в облицованных гранулах их извлекают из жидкого азота пинцетом и помещают в воду температурой 38-40ºС на 5-10 с до появления тонкого стерженька льда. Оценку активности спермиев производят под микроскопом при температуре 38-40 ºС. Для этого вскрывают гранулу, наносят на предметное стекло каплю спермы, добавляют к ней раствор натрия лимоннокислого и исследуют.

Для искусственного осеменения коров и телок замороженную сперму после оттаивания допускают с оценкой активности спермиев не ниже 4 баллов.

Замораживание спермы жеребца

Перед замораживанием сперму жеребца разбавляют в 4 раза лакто-хелато-цитратно-желточной (ЛХЦЖ) или лактозо-желточно-сульфатной (ЛЖС) средой.

После разбавления сперму охлаждают до 0ºС и выдерживают при этой температуре 2 часа. Охлажденную сперму разливают в алюминиевые пакеты по 13 мл, плотно закрывают. Пакеты со спермой замораживают в охлажденном газе над жидким азотом в специальном устройстве, после чего их переносят в хранилище с жидким азотом.

Оттаивание производят путем погружения алюминиевого пакета на 1-2 мин. в водяную баню при температуре 38-40ºС. После чего их вытирают стерильной марлей, обеззараживают 96%-ным спиртом, обрезают стерильными ножницами край пакета и стеклянной палочкой берут каплю спермы, добавляют к ней каплю 2,9 %-ного раствора натрия лимоннокислого и оценивают активность спермиев. Подвижность спермиев в оттаявшей сперме должна быть не ниже 2 баллов.

Техника безопасности при работе с сосудами Дьюара

необходимо закрывать незащищенные участки тела;

работать следует в защищенных очках, на руки надевать брезентовые или кожаные рукавицы;

незащищенный участок тела, на который попал жидкий азот, быстро обливают водой;

при заливке жидким азотом неохлажденного сосуда нельзя заглядывать в горловину сосуда;

помещения, где хранят жидкий азот, оборудуют приточно-вытяжной вентиляцией (повышение концентрации азота в воздухе вызывает головную боль, головокружение и потерю сознания);

нельзя плотно закрывать сосуды Дьюара;

при транспортировке с азотом их следует хорошо фиксировать;

во избежание взрыва сосуды отогревают в изолированном помещении;

для предотвращения накопления взрывоопасной смеси в емкости содержание кислорода следует контролировать с помощью переносного газоанализатора ГХП-3.