.Инструкция

По применению стандартного универсального реагента для определения резус-фактора Rh₀ (Д) в пробирке без подогрева.

Оснащение: Специально приготовленный универсальный реагент антирезус

Rh₀ (Д), стандартные резус-положительные и резус-отряцательные эритроциты для контроля, пробирки, пипетки Пастера, Физиологи­ческий раствор

Для определения резус-фактора может быть использоваться свежая несвернувшаяся кровь, взятая из пальца непосредственно перед исследованием, или консер­вированная» без всякой предварительной обработки, а также эритроциты из пробирки после загустения образования сгустки и отстаивания сыворотки.

Техника определения: На дно пробирки внести 2 капли стандартного реагента актирезус и I каплю иследуемой крови /или эритроцитов/ Содержимое пробирки перемешать встряхиванием и затем медленно поворачивать, наклоняя пробирку почти до горизонтали таким образом, чтобы содержимое рас­текалось по ее стенкам. Такое размазывание крови по стенкам пробирки делает реакцию более выраженной. Как правило, агглютинация наступает в течении пер­вой минуты, но для образования устойчивого комплекса антиген+антитело и четко выраженной агглютинации, а также ввиду возможности замедленной реакции при слабой зараженной агглютинабельности эритроцитов контакт эритроцитов с реа­гентом при повертывании пробирки следует проводить не менее трех минут, а затем для исключения неспецифической агрегации эритроцитов а пробирку добавить 2—3 мл физиологического раствора NaCL и перемешать, не взбалтывай путем 2-3--кратного перевертывания пробирки. Оценку производить визуально.

Одновременно с исследованием крови сольных или доноров производится контрольное исследование стандартных резус-положительных эритроцитов той же группа или группы О /I/ по системе АБО и стандартных резус-отрицательных эри­троцитов обязательно одногрупных с исследуемой кровью.

Оценка результатов: Наличие агглютинации з виде крупных хлопьев из эритроци­тов на фоне просветленной жидкости указывает на резус-положительную принад­лежность исследуемой крови Rh+.

Отсутствие агглютинации (в пробирке гомогенно-окрашенная жидкость) указывает на резус-отрицательную принадлежность исследуемой крови (Rh-).

^результат учитывается как истинный после проверки контрольных образцов. Т.е. при положительном результате со стандартными резус-положительными эри­троцитами и отсутствии агглютинации со стандартными резус-отрицательными эритроцитами, одногрупными с исследуемой кровью по системе AB0.

Разработана Горькрвской областной станцией

переливания крови – А.А. Михайловой

.Гемолитическая болезнь новорожденных

Имельда М. Бромидов (DiaMed AG, Швейцария)

Материалы лекции, Государственная Референс Лаборатория иммуногематологии, Северо-эстонский центр крови, г. Таллинн 20 августа 1999 г.

Информация подготовлена: центральный офис DiaMed-Vostok, г. Москва

Гемолитическая болезнь новорожденных (ГБН) результат гемолитической анемии, при которой разрушение внутриутробных эритроцитарных клеток проявляется в проникновении иммуноглобулина G (IgG) через трансплацентарный барьер.

История диагностирования ГБН

Французский акушер Луи Бурже впервые описал ГБН в 1609 г. Роженица родила близнецов. У первого новорожденного сразу же проявились симптомы гидрамнионизма, и он погиб во время родов. У второго новорожденного развилась желтуха, и он погиб через несколько дней.

В 1932 г. Диамонд с сотрудниками проанализировал эти два клинических проявления одной и той же болезни, которую они назвали эритробластозом плода.

В 1938 г. Дарроу отметил, что гемолиз произошел из-за материнских антител, которые, пройдя через плаценту, попали в кровяное русло плода.

В последующие годы Левин и Стетсон зафиксировали необычную посттрансфузионную реакцию. Женщина разродилась мертвым плодом с эритробластозом, и ей была произведена гемотрансфузия кровью ее супруга. Роженица и ее муж имели О группу крови, однако произошла мгновенная посттрансфузионная реакция. Был сделан вывод, что ребенок унаследовал групповые антигены от отца. Это было первое описание анти-D антител.

В 1940 г. Ландштайнер и Винер описали систему Rhesus и резус антитела, которые были идентичны антителам, описанным Левиным и Стетсоном.

С недавних пор известно, что резус-антитела, которые вырабатываются обезьянами, кроликами, свиньями и человеческие анти-D антитела не одно и то же, и сейчас они переименованы в анти-Ландштайнер и Винер антитела. Через 14 лет Чоун доложил, что сенсибилизация матери произошла из-за поступления крови плода в кровоток матери.

Чаще всего первичная сенсибилизация происходит после перового родоразрешения резус-положительным ребенком. Сосуды плаценты и соединительная ткань разрываются во время родов, и прежде чем материнские сосуды восстановятся, клетки плода могут проникнуть в резус-отрицательное кровяное русло матери. Первичная сенсибилизация может проявиться в синтезе IgM антител, в отсутствие антител в иммунокомпетентных клетках (В-лимфоцитах), или В-лимфоцитов, выполняющих функцию клеток памяти.

При последующем сенсибилизирующем раздражении тем же антигеном, иммунокомпетентные клетки будут продуцировать IgG антитела. Они в отличие от IgM антител проходят через плаценту и попадают в кровяное русло плода.

При ГБН нужно учитывать клинически значимые антитела. Обычно специфичность антител служит признаком клинических проявлений болезни. Анти-D антитела - основная причина большинства случаев тяжелых ГБН, анти-с, анти-Kell и некоторые анти-Е антитела также являются важной причиной серьезных проблем.

Разумеется антитела этой специфики могут быть обнаружены и при легких формах ГБН или могут быть представлены в крови матери и плода не по причине ГБН.

При патологической беременности антитела проходят сквозь плаценту, попадают в кровь и ускоряют иммунное разрушение клеток. Тяжесть заболевания оценивается клиническими проявлениями.

ГБН может быть легкой, средней или тяжелой формы. Количество случаев тяжелых форм ГБН, обусловленных анти-D антителами и заканчивающихся драматически, резко уменьшилось с введением в 1968 г. профилактических мер, проводимых всем Rh-D (-) женщинам, которые разрешались Rh-D (+) детьми. В 1992 г. в Великобритании зафиксировано 1, 3 смертей от Rh-D ГБН из 100.000 новорожденных. Анти-с было найдено у 7 из 1.000 беременных женщин. Коэффициент смертности анти-с аллоиммунизированных беременностей был около 4 в год в Великобритании. Анти-Kell ГБН - 1 на 40.000 может быть очень тяжелой. Титр антител у зародыша в 4 раза меньше, чем у взрослого, активизируются они на 4-5 неделе беременности, а механизм действия антител заключается в угнетении эритропоэза плода. Во избежание недооценки тяжести заболевания необходимо исследовать амниотическую жидкость на содержание биллирубина, с учетом анемии плода..

Чтобы избежать проблем, акушерам необходимо следить за женщиной на протяжении всей беременности. Всем беременным обязательно определяют группу крови, Rh-принадлежность, аллоиммунные антитела не менее 2-х раз в течение каждой беременности. Необходимость в дополнительном исследовании зависит от наличия аллоантител; методики, которой они выявлены. Дополнительно рекомендуется исследование фенотипа отца; определение группы крови плода. После родов Rh-D отрицательным женщинам, которые разрешились Rh-D положительными детьми, у которых не выявлены анти-Rh аллоантитела.

Стандартная доза послеродовой профилактики - 100 jLtg анти-D иммуноглобулина. Правила определения и профилактики анти-D антител едины во всей Европе (правило №1). Мероприятия по профилактике также зависят от количества фетальных эритроцитов, попавших в сосудистое русло матери, у сенсибилизированных женщин. В Англии - 1, 5%, в Голландии - 0, 65%, в Бельгии- ноль%, анти-D профилактика в Бельгии базируется на специальном методе (Kleihaeur testing). Основой этого метода является невосприимчивость гемоглобина плода к кислотной среде.

Центральный офис фирмы DiaMed AG в России

107370, Москва, Бойцовая ул., 27 тел. (095) 169-01-83, факс (095) 169-01-27, e-mail: diamed-v@cityline.ru http://www.user.cityline.rur diamed-v

Прямая реакция аглютинации

На плоскости:

На смачиваемую (обезжиренную) поверхность светлой керамической пластики нанести одну каплю (),1 мл) Анти-Д Супер Цоликлона. Рядом поместить маленькую (10 мкл) каплю исследуемой крови индивидуальной чистой стеклянной палочкой. Реакция агглютинации развивается уже через 30 секунд при мягком покачивании пластинки, практически полностью ,реакция проходит за 60 секунд. Результаты учитываются уже через 3 минуты после смешивания капель, поскольку реакция агглютинации эритроцитов, несущих слабую форму D-антигена протекает медленнее. Положительный результат тестирования проявляется в проявлении агглютинации (склеивания) эритроцитов, которую можно наблюдать невооруженным глазом, поскольку капля быстро просветляется, а эритроциты образуют крупные, хорошо различимые ярко-алые агрегаты. При отрицательном результате гемагглютинация не развивается, капля продолжает оставаться равномерно окрашенной в красный цвет, агрегаты в ней не обнаруживаются.

ИНСТРУКЦИЯ

ПО ПРИМЕНЕНИЮ РЕАГЕНТА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗУС-ПРИНАДЛЕЖНОСТИ

КРОВИ ЧЕЛОВЕКА НА ОСНОВЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

«Анти-D Супер ЦОЛИКЛОН»

Рекомендована к утверждению экспертной комиссией по лабораторным реагентам Комитета по новой медицинской технике Минздрава РФ (протокол №8 от 28 декабря 1998г.)

НАЗНАЧЕНИЕ

Анти-D Супер Цоликлон – жидкий диагностический реагент для определения резус-принадлежности крови человека – предназначен для качественного выявления в эритроцитах человека Rh(D)-антигена системы «резус». Применяется в учреждениях службы крови, клинико-диагностических лабораториях и в научно-исследовательской практике. Нара рассчитан на проведение 1000 определений при расходе по 0,1 мл реагента на 1 анализ

ПРИНЦИП МЕТОДА

Основным принципом метода типирования крови при помощи моноклональных антител является реакция антиген-антитело. Активные центры антител определенной специфичности связываются с мембранными антигенами эритроцитов крови, что вызывает агглютинацию (склеивание) эритроцитов, легко наблюдаемое визуально. Наличие агглютинации эритроцитов исследуемой крови человека под действием моноклональных антител определенной специфичности однозначно свидетельствует о том, что данные эритроциты несут антиген данной специфичности.

СОСТАВ РЕАГЕНТА

Реагент Анти-D Супер Цоликлон, представляет собой раствор анти-D моноклональных антител в 0,2% растворе NaCl с добавлением 2% бычьего сывороточного альбумина, 7% глюкозы и азида натрия (0,1%) в качестве консерванта.

АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ РЕАГЕНТА

Анти-D Супер Цоликлон – жидкий диагностический реагент для определения резус-принадлежности кров человека – представляет собой раствор полных антител, относящихся к иммуногобулинам класса М, специфичности анти-D. Титр (концентрация) антител в реагенте Анти-D Супер Цоликлон соответствует значению 1:256 в прямой реакции агглютинации с D-положительными эритроцитами в микроплате при титровании 2% раствором бычьего сывороточного альбумина (титр 1:32 в прямой реакции агглютинацииD-положительных эритроцитов на плоскости). Авидность (геммаглютинирующая активность) – 60 секунд. В реакции используется по 0,1 мл реагента и примерно 0,01 мл крови или эритроцитов. Воспроизводимость результатов резус-типирования крови человека реагентом Анти-DСупер Цоликлон – 100%. Результат типирования не зависит от форм антигена Dв исследуемых эритроцитах (сильные или слабые).

АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ПРОБЫ

Анализ может проводиться с образцами нативной крови или эритроцитов, полученных ил венозной, артериальной или капиллярной крови, как взятой в консервант, так и без консерванта.

Следует избегать загрязнения анализируемого образца эритроцитами из другой пробы, Т.К. вследствие высокой чувствительности реагентов сравнительно небольшой количество иммуно-активных загрязнений может привести к ложно-положительной реакции.

Срок пригодности образцов крови человека для их типирования с помощью Цоликлона ограничен 7 сутками хранения при температуре +2 … +8 градусов по Цельсию.