5∙103 Трансформантов/мкг (5 умножить на 1000)

Как записать в научном виде 40 000 трансформантов/мкг?

Последний пример: если эффективность трансформации составила 2600 трансформантов на мкг, это будет записано как:

2.6∙103 Трансформантов/мкг (2.6 умножить 1000)

Аналогично:

5 600=5.6∙10³

271 000=2.71∙10⁵

2 420 000=2.42∙10⁶

Как записать в научном виде 960 000 трансформантов на мкг?

Запишите вашу рассчитанную эффективность трансформации в стандартном виде:

Опишите одним-двумя предложениями, что означает понятие эффективность трансформации.

Известно, что эффективность, которая обычно достигается при использовании нашего протокола – от 8∙10² до 7∙10³ трансформантов на мкг ДНК.

Как эффективность трансформации, которую вы получили, соотносится с этими цифрами?

В таблице ниже, запишите значения эффективности трансформации, полученной другими парами из вашего класса:

Пара	Значение эффективности трансформации

Как соотносится ваше и их значения?

Рассчитайте эффективность трансформации в следующем эксперименте, используя предоставленные значения:

Концентрация плазмиды – 0.08 мкг/мкл

250 мкл раствора CaCl₂

10 мкл раствора плазмиды

250 мкл питательной среды

100 мкл суспензии было растерто по чашке

227 колоний было насчитано

Заполните таблицу и покажите ваш расчет учителю:

Число колоний на чашке LB/amp/ara
Количество микрограмм ДНК на одну чашку
Эффективность трансформации

Дополнительное задание:

Если в каком-то эксперименте была получена эффективность трансформации 3∙10³, сколько колоний выросло на чашке? Примите концентрацию ДНК и долю ДНК, приходящуюся на одну чашку такими же, как в вашей работе.

Приложение А

Историческая справка

Биологическая трансформация имеет интересную историю. В 1928 году Фредерик Гриффит, лондонский врач, провел эксперимент, который так никогда и не смог полностью интерпретировать до конца своей жизни. Гриффит превратил (трансформировал) непатогенный, безопасный штамм пневмококка в смертоносный патогенный штамм. Он сделал это, обрабатывая безопасный штамм убитыми нагреванием патогенными бактериями. В этой смеси не было живых патогенных бактерий, однако она убивала мышей, которым ее вкалывали. Он повторял этот эксперимент много раз, с неизменным результатом. Гриффит и его коллеги были очень озадачены: что же превращало безвредных бактерий в смертельно опасных? Много лет спустя это событие станет известным как первый описанный случай генетической трансформации, но тогда никто не мог его объяснить. Гриффит не знал про ДНК, хотя знал, что трансформация наследуется. Эксперименты Гриффита могут считаться началом манипуляций с генами, которые привели к технологии рекомбинантной ДНК, биотехнологии и генной терапии.

В 1944 году, 16 лет спустя после экспериментов Гриффита, группа исследователей в Рокфеллеровском институте под руководством Освальда Т. Эвери опубликовал статью, ставшую непосредственным продолжением работы Гриффита. «Какое вещество отвечает за трансформацию?» спрашивал у своих коллег Эвери. Они работали с теми же штаммами бактерий, что и Гриффит ,и получили точный ответ: ученые доказали что трансформирующим веществом является ДНК и что для прохождения трансформации чужеродная ДНК должна проникнуть в клетки и начать там работать.

Хотя современникам потребовалось много лет, чтобы оценить работу Эвери, сегодня его фундаментальный вклад в биологическое знание.является общепризнанным. Основываясь на работе Эвери и других, Дуглас Ханахан разработал метод трансформации колоний, который вы использовали в этой работе^1,2.

Генетическая трансформация в контексте истории

1865-Грегор Иоганн Мендель: Мендель представил свои исследования, касающиеся принципов, по которым признаки передаются от родителей потомкам. Из его работы впоследствии вытекло понятие гена, как базовой единицы наследственности.

1900-Карл Корренс, Хуго де Фриз и Эрих Чермак: генетики растений, проводившие исследования наследственности, обнаружили, что их работа является копией работы, проведенной 40 лет назад неизвестным австрийским монахом-августинцем Грегором Менделем, изучавшим закономерности наследования признаков у гороха.

1928-Фредерик Гриффит: Гриффит трансформировал непатогенный штамм Diplococcus pneumonia в патогенный, используя убитых нагреванием вирулентных бактерий. Он предположил, что трансформирующий фактор как-то связан с синтезом полисахаридной капсулы. Гриффит не знал о существовании ДНК, но знал, что приобретенный при трансформации признак наследуется. Эксперименты Гриффита могут считаться началом манипуляций с генами, которые привели к технологии рекомбинантной ДНК, биотехнологии и перспективам манипуляций с человеческими генами.

1944-Освальд Т. Эвери, Колин МакЛеод: Эвери и его коллеги объявили, что им выделить с высокой чистотой трансформирующий фактор, и им оказалась ДНК. Со времени этого классического эксперимента, трансформация, а также коньюгация (аналог полового процесса у бактерий) и трасдукция (перенос ДНК вирусными частицами) используются для передачи генов между разными видами бактерий, мух (Drosophila), мышей, растений, культур клеток млекопитающих и генной терапии человека.

1977-Корпорация «Генентех»: первый продукт генетической инженерии, ген соматостатина (вещества, тормозящего выброс человеческого гормона роста) был экспрессирован в бактериях для промышленного производства.

1980-Джон Гордон, Фрэнк Раддл: Гордон и Раддл создали первую трансгенную мышь, введя чужеродные гены в оплодотворенные яйцеклетки мышей.

1982-Ричард Пальмитер, Ральф Бринстер: Пальмитер и Бринстер ввели ген крысиного гормона роста эмбрионам мышей. Получившиеся в результате мыши были названы «супермышами» из-за крупного размера.

1988-Стивен Розенберг: Розенбергу и его коллегам удалось получить разрешение на первый эксперимент по внедрению генов людям – пациентам, страдающим от метастазирующей меланомы. Эксперимент был направлен на отслеживание перемещений опухоли с помощью маркерного гена Neo^R и не являлся генной терапией.

1990-Френч Андерсон, Майкл Блезе, Кеннет Калвер: В 12:52 в пятницу, 12 сентября 1990 года в Национальном иституте рака 4-летняя девочка Ашанти ДаСилва из Кливленда стала первой пациенткой, подвергшейся генной терапии. Ей были введены ее собственные белые кровяные клетки, содержащие исправленную копию гена деаминазы аденозина (ADA). На протяжении года д-р Андерсон, Блезе и Калвер на ожидали от эксперимента значимых результатов. Второй девочке, Синтии Катшолл была сделана аналогичная иньекция в том же году. На фотографиях в отчете, сделанных в июне 1993 года можно увидеть обеих девочек улыбающимися и играющими в школьном дворе. Иммунная система у обеих девочек работала нормально.

1994-Другими кандидатами на лечение с помощью генной терапии являются серповидноклеточная анемия, гемофилия, рак, диабет и сердечно-сосудистые заболевания. Генная терапия половых клеток обсуждается на встрече Комитета по рекомбинантной ДНК. В 1996 одобрения Комитета по генной терапии ждет все растущее число предложений.

1995-Группа Крейга Вентера в Институте исследования генома в Мэриленде опубликовала последовательность генома бактерии Hemophilus influenzae. Таким образом, впервые был расшифрован геном свободноживущей бактерии.

1996-Межнациональная исследовательская группа, объединившая более 100 лабораторий из Европы, США, Канады и Японии впервые расшифровала геном эукариотического организма, дрожжей Saccharomyces cerevisiae. S. cerevisiae это коммерчески важный штамм дрожжей, используемый в пищевой промышленности и кроме того важный модельный объект для изучения генетики и молекулярной биологии эукариот.

1998-было опубликовано 99% последовательности генов первого многоклеточного организма крошечного круглого червя Caernohabditis elegans. Хотя C. elegans примитивный организм, он разделяет с людьми многие важнейшие генетические и биологические механизмы и может помочь ученым найти и охарактеризовать гены, ответственные за биологические процессы и заболевания человека.

Ученые создали подробную карту для большинства из известных 30 000 человеческих генов, что стало важной вехой для проекта «Геном человека».

1997-Ученые под руководством Яна Вильмута в шотландском институте Рослин объявили об успешном клонировании овцы, названной Долли, из соматической клетки вымени. Клонирование Долли вызвало взрыв обсуждения этических и моральных вопросов, связанных с клонированием, во всем мире. Вслед за этим, ученые из института Рослин в сотрудничестве с шотландской компанией «ППЛ Терапьютикс» успешно клонировала двух генетически модифицированных ягнят, названных Полли и Молли, молоко которых содержало человеческий белок свертываемости крови (фактор IX) который мог быть выделен из молока и использован для лечения гемофилии.

2000 – команда исследователей, возглавляемая Инго Потрикусом из Швейцарского федерального института технологии в Цюрихе и Питером Бейером из университета Фрайбурга в Германии доложили о создании генетически модифицированного риса, названного «золотым рисом». «Золотой рис» содержит большое количество бета-каротина, вещества, которое в организме людей превращается в витамин А. «Золотой рис» может избавить миллионы бедных людей по всему миру от куриной слепоты, вызванной недостатком витамина А.

Геном плодовой мушки Drosophila melanogaster был расшифрован при сотрудничестве компании «Селера Джиномикс» и исследователей по всему миру. К тому моменту плодовая мушка, широко используемая для научных исследований, была самым крупным организмом с рашифрованным геномом.

«Черновой» вариант человеческого генома был закончен командой из 16 международных организаций, образующих консорциум по расшифровке генома человека. Компания «Селера» также объявила об завершении своей «первой сборки» генома.

2001-12 февраля 2001 года, «Селера Джиномикс» и международный консорциум по секвенированию генома человека вместе опубликовали практически полный вариант генома человека – генетического «чертежа» человеческого существа. Эта работа заняла более 20 лет у международной команды и потребовала сотрудничества тысяч ученых по всему миру. «Селера Джиномикс» объявила, что провела работу приблизительно за девять месяцев. Две группы расходились в их оценках числа генов, но по любым оценкам, геном содержал от 25 000 до 40 000 генов – намного меньше, чем предыдущие оценки в 100 000 генов. Это был неожиданный результат: оказалось, что такой сложный организм как человеческое существо может быть создан, используя сравнительно небольшое число генов, всего в два раза больше чем у мухи D. melanogaster или червя C. elegans. Появление полной последовательности генома позволило исследователям по всему миру начать работу по поиску лекарств от разных генетических болезней.

Президент Джордж Буш-мл. постановил, что только эксперименты с уже существующими 64 линиями эмбриональных стволовых клеток могут получать государственное финансирование в США. Это решение разочаровало многих ученых, которые надеялись использовать эмбриональные стволовые клетки для лечения болезней.

«ППЛ Терапьютикс», компания, помогавшая клонировать овцу Долли, объявила о клонировании пяти генетически модифицированных поросят.с инактивированным («выбитым») геном, что значительно повышало шансы на то, что органы таких животных не будут отторгнуты при трансплантации. Это известие подарило надежду тысячам людей, ожидающих донорских органов, таких как сердце, легкие, печень или почки.

2002-у овцы Долли, первого клонированного млекопитающего, развился артрит в сравнительно раннем возрасте пяти лет. Было неясно, являлось ли состояние Долли следствием генетических нарушений, произошедших при клонировании, или это было простым совпадением. Эта новость возобновила дискуссии о том, подвержены ли клонированные животные преждевременному старению и проблемам со здоровьем, и стала неприятным известием для сторонников клонирования в качестве источника органов для трансплантации.

2008-Нобелевская премия по химии присуждается за открытия и применение зеленого флуоресцентного белка (GFP). Осаму Шимонура первым выделил GFP и обнаружил его способность флуоресцировать при освещении ультрафиолетом. Мартин Чалфи впервые использовал GFP как светящийся генетический маркер. Роджер Цин раскрыл механизм флуоресценции GFP.

Приложение Б

Словарь терминов

Агар Полисахарид, добываемый из водорослей. При добавлении в питательную среду делает ее плотной как желе и она может служить опорой для роста бактерий.

Арабиноза Сахар, который бактерии используют в качестве одного из источников пищи

Бактериальная библиотека Совокупность клеток E. coli, трансформированных рекомбинантными векторами, несущими в качестве вставок все возможные гены некоторого организма.

Бета-лактамаза Белок, дающий устойчивость к антибиотику ампициллину. Производится и секретируется бактериями, содержащими плазмиду с геном bla. Бета-лактамаза расщепляет ампициллин, содержащийся в среде, и позволяет получившим плазмиду клеткам расти.

Библиотека ДНК ДНК, выделенная из клетки любого организма, может быть порезана на куски, а эти куски все вместе помещены в плазмиды, так что одна плазмида содержит один кусочек исходной ДНК. Таким образом, создается популяция рекомбинантных плазмид. Далее эти плазмиды помещаются в бактерии, причем внутрь каждой клетки попадает одна-единственная плазмида, которая потом многократно копируется. Таким образом, все клетки содержат одинаковую ДНК вектора, но разные ДНК «вставок». Если исходная ДНК была порезана на 1000 кусков, образовалось 1000 рекомбинантных молекул и 1000 трансформированных клеток, каждая из которых содержит 1 кусочек исходной ДНК. Такой набор клеток называется библиотекой ДНК. Интересующие нас участки могут быть найдены в библиотеке с помощью соответствующих проб (комплементарных молекул ДНК)

Биотехнология Применение биологических знаний к окружающему миру, манипулирование живыми организмами и изменение свойств на генетическом уровне для получения полезных продуктов.

Вектор Молекула ДНК, способная автономно реплицироваться (воспроизводиться) в клетках-хозяевах, в которую были встроены чужеродные фрагменты ДНК (например, плазмида)

Генетическая инженерия Манипулирование генетическим материалом организма путем введения или удаления отдельных генов.

Зеленый флуоресцентный белок (Green Fluorescent protein, GFP) GFP был первоначально выделен из медузы Aequorea victoria. Ген зеленого флуоресцентного белка был выделен и клонирован. GFP обладает уникальной пространственной структурой, позволяющей ему флуоресцировать (поглощать ультрафиолет и испускать поглощенную энергию в виде яркого зеленого света)

Клонирование Когда одна клетка митотически (без участия полового процесса) делится, она дает начало генетически идентичной (клональной) популяции клеток. Клонирование – процесс создания такой популяции. Для клонирования отдельного гена соответствующую ДНК вводят в плазмиду, которой трансформируют бактерии. Для того, чтобы отобрать трансформированные бактерии, в плазмиды вводят ген устойчивости к антибиотику, например ампициллину, в присутствии которого погибают все бактерии, не имеющие клонируемой плазмиды. Размножаясь, бактерии многократно увеличивают количество ДНК.

Колония Потомство одной бактерии, генетически идентичные бактериальные клетки, выросшие на чашке. Так как все клетки в составе колонии генетически идентичны, все они являются клонами.

Отбор на устойчивость к антибиотикам Плазмида, используемая для того, чтобы перенести нужный ген в бактерию, также содержит ген бета-лактамазы, дающий устойчивость к антибиотику ампициллину. Белок бета-лактамаза производится и секретируется наружу получившими плазмиду бактериями. Этот фермент расщепляет присутствующий в среде LB/amp ампициллин и позволяет бактериям расти. Таким образом, несмотря на то, что очень небольшой процент бактерий принимает в себя плазмидную ДНК в процессе трансформации, на среде с антибиотиком выживают только они, остальные погибают.

Питательная среда Жидкая и агаризованная среда LB (Лурия-Бертани) сделана из дрожжевого экстракта и гидролизата мясных субпродуктов и представляет собой смесь углеводов, аминокислот, нуклеотидов, солей и витаминов, необходимых для роста бактерий. Агар, который производится из водорослей, расплавляется при нагревании, а когда остывает, образует твердый гель, напоминающий желе. Он функционирует в качестве подложки, на которой растут бактерии.

Плазмида Кольцевая молекула ДНК, способная автономно реплицироваться, содержащая один или несколько генов устойчивости к антибиотикам.

Плазмида pGLO Плазмида, содержащая ген зеленого флуоресцентного белка и ген устойчивости к ампициллину (бета-лактамазу)

Посев Процесс, когда вы проводите петлей по агару или опускаете ее в жидкую среду, чтобы перенести туда бактерий.

Регуляция работы генов Работа генов у всех живых организмов тщательно регулируется, чтобы оптимально приспосабливать обмен веществ к постоянно меняющимся условиям окружающей среды и не допускать излишнего производства ненужных в данный момент белков. Хорошими примерами являются гены, отвечающие за поглощение и переработку пищи. Например, сахар арабиноза может быть использована бактериями в качестве источника энергии и углерода. Если арабинозы в окружающей среде нет, ферменты, отвечающие за ее переработку в клетке не производятся, соответствующие гены молчат. Белки, необходимые для катаболизма арабинозы начинают синтезироваться только при наличии этого сахара в среде. Когда она «съедается» и заканчивается, гены вновь выключаются. См. приложение D для более детального описания того, как арабиноза регулирует экспрессию зеленого флуоресцентного белка.

Скрининг Процесс идентификации нужных бактерий в библиотеке

Техника стерильной работы Техника работы, при которой минимизирована вероятность заражения образцов бактериями из окружающей среды. (См. Приложение В)

Технология рекомбинантной ДНК Процесс разрезания и сшивания разных молекул ДНК друг с другом, с целью выделения нужных генов или их изменения.

Приложение В

Техника стерильной работы

Выполняя любые микробиологические эксперименты, важно не занести бактерий из внешней среды. Так как бактерии находятся везде – на кончиках пальцев, на поверхности стола, в воздухе и.т.п. важно минимизировать контакт образцов с окружающей средой. Когда ученики работают с петлями, пипетками или чашками Петри, вы должны подчеркнуть, что к кончику петли, носику пипетки или поверхности чашки нельзя прикасаться ни при каких обстоятельствах. Несмотря на то, что небольшое загрязнение вряд ли сильно повлияет на этот эксперимент, привычка к чистой работе в будущем пригодится ученикам. Использование стерильной техники это так же и вопрос человеческого здоровья и гигиены.

Приложение Г

Основные концепции и терминология молекулярной биологии

Исследования живого мира показали, что все живые организмы передают точную схему своего строения потомству. Самая маленькая единица живого ,способная к самовоспроизводству, это клетка. Например, многие бактерии способны существовать как отдельные клетки. Химические молекулы, из которых состоят клетки вместе выполняют согласованную работу.

Клетки могут быть выращены в культуре и собраны

Клетки могут быть отобраны из природы и выращены в специальных условиях в лаборатории. Для роста клеток им нужна определенная среда и питательные вещества. Бактерии и дрожжи очень просто вырастить в культуре. Клетки растений и животных тоже можно вырастить, но это сложнее сделать. После того как культура клеток выросла, клетки можно собирать и изучать.

Клонирование

Когда одна клетка делится митотически, все ее потомство генетически идентично. Такая популяция клеток называется «клональной». Процесс создания клональной популяции называется «клонированием». Цель посева бактерий на агар – вырастить отдельные колонии клеток, каждая из которых происходит из одной единственной клетки.

Внутри клетки

Каждая молекула внутри клетки выполняет свою функцию. Например, ДНК сохраняет информацию (как жесткий диск компьютера), а белки это «рабочие лошадки» клетки. Для того, чтобы изучать какой-то тип молекул, мы выращиваем клональную популяцию определенного типа клеток, разрушаем их, и упорядочиваем содержимое. Например, мы можем сравнительно легко отделить все белки от всех молекул ДНК.

Выделить один интересующий нас белок из всех остальных клеточных белков также возможно. У каждого белка свои уникальные физические и химические свойства, которые позволяют отделить его от других. Например, можно разделять белки по размеру, заряду, гидрофобности и.т.д.

Специализированные молекулы для специальных функций

Мы более детально рассмотрим три основных вида молекул, находящихся в клетке: ДНК, РНК и белки. У каждой из этих молекул есть своя функция. Молекулы ДНК похожи на ящики картотеки, в которых хранится информация. РНК помогают достать и выполнить заложенные в ДНК инструкции. Белки выполняют большинство рутинных химических операций внутри и зачастую вне клетки.

ДНК: универсальное хранилище биологической информации

Главная «программа», управляющая каждым живым организмом, заложена в его дезоксирибонуклеиновой кислоте (ДНК). Информации, заложенной в ДНК, достаточно для выполнения любой функции, которую клетка потенциальна способна выполнить.

Молекулы ДНК это очень длинные цепи, составленные из повторяющихся единиц. Каждая такая единица (нуклеотид) содержит одно из четырех возможных «оснований»

АДЕНИН («А)»	ЦИТОЗИН («Ц»)
ТИМИН («Т»)	ГУАНИН («Г»)

Нуклеотиды («звенья» цепи) соединены друг с другом «голова к хвосту», а основания торчат в сторону. Информация закодирована в виде последовательности «букв» А, Т, Г, Ц вдоль цепи ДНК.

Некоторые дополнительные вещи относительно структуры ДНК:

1. Так как нуклеотиды, составляющие цепь ДНК, соединяются друг с другом «голова к хвосту», то каждая цепь имеет направление, т.е. «ААЦТГ» это не то же самое, что «ГТЦАА». Ученые условились писать последовательности ДНК начиная с так называемого « 5` конца» и заканчивая «3` концом» например так: 5`…ААЦТГ…3`

2. Торчащие в сторону основания способны образовывать пары с основаниями на другой цепи ДНК, по правилам:

(i) «А» образует пару с «Т»

(ii) «Г» образует пару с «Ц»

А и Т называются «комплементарными» (взаимно дополняющими) основаниями, так же как Г и Ц.

(iii) Для того чтобы две цепи ДНК образовали двухцепочечную молекулу, они должны быть взаимно комплементарными (каждое из оснований одной цепи комплементарно основанию расположенному напротив на другой цепи) и идти в противоположных направлениях. Например, (5`…АГГТЦ…3`) образует пару с (5`…ГАЦЦТ…3`). У этих двух цепей ДНК комплементарные последовательности. Двухцепочечная пара обычно записывается так:

5`…АГГТЦ…3`

3`…ТЦЦАГ…5`

Такая двухцепочечная молекула ДНК содержит 5 пар оснований. В природе ДНК почти всегда состоит из двух цепей, комплементарных друг другу.

3. Молекулы ДНК обычно состоят из тысяч, иногда миллионов пар оснований! Иногда два свободных конца молекулы ДНК соединяются вместе, образуя кольцевую молекулу ДНК (например, плазмиды – это кольцевые молекулы ДНК)

4. Каждый нуклеотид в каждой цепи ДНК чуть-чуть повернут относительно предыдущего, и в итоге вся цепь оказывается закручена по спирали. Так как молекула ДНК состоит из двух цепей, о ДНК говорят как о «двойной спирали».

Строение ДНК делает возможным очень простой способ самовоспроизведения. Две цепи в составе молекулы ДНК расплетаются и на каждой цепи ферментом «ДНК-полимеразой» синтезируется новая комплементарная цепь. В итоге образуются две дочерние молекулы, каждая из которых является двухцепочечной и идентичной по последовательности родительской. При этом одна из цепей в составе каждой дочерней молекулы досталась прямо от родительской молекулы, а другая была заново создана.

Белки и РНК: «рабочие лошадки» клетки

Жизнь состоит из множества точных и эффективных химических реакций, протекающих одновременно. Основными участниками этих реакций являются сравнительно короткоживущие молекулы белков и РНК, которые могут работать отдельно друг от друга, или объединяться в комплексы. Как и ДНК, это полимеры – длинные цепи, составленные из повторяющихся звеньев.

РНК

РНК (рибонуклеиновая кислота), как и ДНК состоит из четырех типов нуклеотидов, соединенных в цепь. Она отличается от ДНК: четырьмя основаниями в РНК являются «А», «Г», «Ц» и «У» (урацил); правила для образования пар между основаниями те же самые ,за исключением того ,что с «А» образует пару «У», а не «Т». Хотя молекула РНК может образовать пару с комплементарной ей цепью ДНК или РНК, в клетке РНК обычно встречается как одноцепочечная молекула. Сахар в составе цепи РНК – рибоза, а не дезоксирибоза. Молекулы РНК обычно гораздо короче в сравнении с молекулами ДНК, потому что каждая РНК является копией маленького фрагмента ДНК. Процесс копирования фрагментов ДНК с образованием комплементарных РНК называется транскрипцией; фермент, который осуществляет этот процесс называется «РНК-полимераза».

Белки

Белки (полипептиды) тоже являются длинными цепями, но они гораздо более разнообразны в структурном плане чем ДНК или РНК. В природе существует более 20 разных видов аминокислот, из которых состоят белки. Последовательность аминокислот в полипептидной цепи определяет, как эта цепь сложится в пространстве и какую трехмерную структуру образует. В свою очередь, эта структура определяет функцию белка.

Таким образом, функция белка определяется его последовательностью.

В большинстве случаев, конкретный белок выполняет одну –единственную функцию. Белки способны выполнять самые разнообразные функции: ферменты являются катализаторами химических реакций; сигнальные белки передают сигналы из одной части клетки в другую, или как гормоны, от одной клетки другой. Антитела связывают чужеродные объекты; структурные белки становятся основой разных физических структур, существующих в клетке; регуляторные белки управляют активностью десятков других.

Линейный код, трехмерные последствия

Первичным хранилищем информации во всех живых клетках является ДНК. Эта информация закодирована в виде линейной последовательности букв «А», «Т», «Г», «Ц» вдоль цепи ДНК. Этот линейный код может быть передан потомству – за счет механизма точного копирования молекул ДНК.

В каждый конкретный момент некоторые участки ДНК транскрибируются. Такие участки называются «генами». РНК-полимераза копирует весь фрагмент, основание за основанием, синтезируя полностью комплементарную цепь РНК, состоящую из букв «А», «Г», «Ц», «У».

ДНК не только является матрицей для копирования, но и предоставляет информацию о том, где транскрипция должна начинаться («промотор») и где заканчиваться; сколько нужно сделать копий и в какой момент; и даже – в виде структуры синтезированной РНК- информацию о стабильности и продуктивности этой РНК!

Существует три основных класса РНК, транскрибируемых с матриц ДНК: это матричные РНК (мРНК), которые содержат информацию для сборки белков; транспортные РНК (тРНК), которые помогают собирать белки и рибосомальные РНК (рРНК) которые являются важнейшими структурными компонентами рибосомы, «фабрики» по сборке белков и катализируют саму реакцию синтеза полипептидной цепи.

мРНК содержат информацию для изготовления белков. В ходе процесса «трансляции», рибосомы переводят эту информацию, закодированную в последовательности нуклеотидов, в последовательность аминокислот в белке. Как они это делают? Ведь существует всего четыре вида нуклеотидов, но более 20 видов аминокислот!

Во время трансляции рибосома считывает нуклеотиды по три сразу, и приписывает каждому «триплету» соответствующую аминокислоту (триплеты часто называют «кодонами»). Каждая следующая аминокислота присоединяется на конец растущей белковой цепи. Существует всего 64 возможных кодона (столько возможно комбинаций из 4 букв по 3), это в несколько раз больше, чем число возможных аминокислот, поэтому сразу несколько кодонов соответствуют одной и той же аминокислоте. Это дает коду определенный запас «устойчивости».

Таким образом, информация, кодированная в линейной последовательности ДНК, используется для того, чтобы собрать линейную последовательность белка. В свою очередь, эта линейная последовательность определяет точную пространственную форму, которую примет белок и его особые химические свойства.

Подводя итог, основной путь передачи информации в клетке таков:

ДНК>>>РНК>>>БЕЛОК>>>ПРИЗНАК

Хотя код линейный, его последствия трехмерные. Основа технологии рекомбинантной ДНК в том, что манипуляции с линейной последовательностью ДНК приводят к желательным постоянным изменениям жизнедеятельности клеток.

Гены это отдельные «файлы» генетической информации

Ген это фрагмент ДНК, с которого транскрибируется РНК. Прямо или косвенно, эта РНК будет выполнять какую-то функцию, поэтому правильно думать о гене, как о единице функции.

Многие признаки, например, устойчивость к антибиотикам, закодированы одиночными генами. Однако большинство признаков, например, форма носа или цвет розы, являются следствием согласованной работы нескольких генов.

Гены могут иметь разную длину: от нескольких сотен до десятков тысяч пар оснований. На одной молекуле ДНК может находиться от десятка до многих тысяч генов. В свою очередь, в клетке может находиться одна или множество молекул ДНК (хромосом). В целом, число генов в клетке очень сильно варьирует. Например, бактерия E. coli содержит одну молекулу ДНК на которой расположено примерно 5 000 генов. Клетка человека содержит 46 молекул ДНК (хромосом) на которых в сумме расположено около 100, 000 генов.

Не все гены, содержащиеся в клетке, транскрибируются с образованием РНК (экспрессируются), в одно время и с одинаковой скоростью. Когда говорят о работе генов, говорят об «уровне экспрессии». Этот уровень контролируется клеткой в соответствии с определенными правилами, в свою очередь закодированными в ДНК.

Например, все клетки нашего тела (все 100 триллионов) содержат одинаковые молекулы ДНК. Тем не менее, клетки печени экспрессируют лишь те гены, которые нужны для функционирования печени, а клетки кожи экспрессируют совсем другой набор генов!

ДНК может быть порезана на части с помощью ферментов рестрикции (рестриктаз)

Рестрикционные ферменты, или рестриктазы, синтезируются бактериями для защиты от чужеродной ДНК, например, вирусной. Эти ферменты узнают короткие последовательности ДНК (4-6 пар оснований) и разрезают все молекулы ДНК, в которых встречается эта последовательность. Например, рестриктаза BamHI узнает последовательность 5`…ГГАТЦЦ…3` и разрезает молекулу ДНК между двух Г в месте узнавания. Рестриктазы могут разрезать ДНК любого происхождения, бактериальную, растительную или животную, главное, чтобы там была последовательность узнавания (сайт рестрикции).

Куски ДНК могут быть сшиты с помощью ДНК-лигазы

ДНК-лигаза это фермент, сшивающий два куска ДНК, если их концы взаимно совместимы. Так, кусок человеческой, или лягушачьей, или ДНК помидора, разрезанной рестриктазой BamHI может быть легко сшит с бактериальной ДНК, если она была также разрезана BamHI. Соединяя молекулы ДНК разного происхождения, можно создавать рекомбинантные (гибридные) ДНК.

Гены могут быть вырезаны из человеческой или растительной ДНК и перемещены в бактерии. Например, можно поместить в бактерии человеческий ген гормона инсулина. В определенных условиях эти бактерии будут синтезировать полностью идентичный человеческому инсулин!

Плазмиды это маленькие кольцевые молекулы ДНК

Плазмиды это маленькие кольцевые ДНК, находящиеся в клетках многих бактерий. Они реплицируют себя с помощью ферментов клетки, в которой находятся. Поэтому они могут находиться неограниченно долго в клетке, существуя там фактически как паразиты.

Благодаря их маленькому размеру, плазмидные ДНК легко выделить из бактериальных клеток. Их можно разрезать рестриктазами и сшить с любой чужеродной ДНК, разрезанной теми же рестриктазами. Получившаяся в результате рекомбинантная плазмида может быть перенесена обратно в бактериальную клетку в процессе трансформации. Рекомбинантные плазмиды реплицируют себя и при этом реплицируется встроенный в них чужеродный ген, каждая плазмида несет его точную копию. Мы говорим, что ген был «клонирован»; плазмида, несущая ген называется «вектором».

Плазмиды не только могут быть использованы для клонирования чужих генов, зачастую они несут свои собственные. Бактерии умирают в присутствии антибиотиков. Тем не менее, существуют гены устойчивости к антибиотикам, которые позволяют бактериям выживать и размножаться в присутствии определенных антибиотиков; например, бета-лактамаза придает устойчивость к ампициллину и другим производным пенициллина. Такие гены часто распространяются между бактериями на плазмидах. Когда в плазмиду встраивается чужеродная ДНК и эта плазмида трансформируется в клетку, гены устойчивости к антибиотикам позволяют легко отобрать те бактерии, которые получили плазмиду – в присутствии антибиотика все остальные бактерии погибнут.

Библиотеки ДНК

ДНК, выделенная из клетки любого организма, может быть порезана на куски, а эти куски все вместе помещены в плазмиды, так что одна плазмида содержит один кусочек исходной ДНК. Таким образом, создается популяция рекомбинантных плазмид. Далее эти плазмиды помещаются в бактерии, причем внутрь каждой клетки попадает одна-единственная плазмида, которая потом многократно копируется. Таким образом, все клетки содержат одинаковую ДНК вектора, но разные ДНК «вставок». Если исходная ДНК была порезана на 1000 кусков, образовалось 1000 рекомбинантных молекул и 1000 трансформированных клеток, каждая из которых содержит 1 кусочек исходной ДНК. Такой набор клеток называется библиотекой ДНК. Интересующие нас участки могут быть найдены в библиотеке с помощью соответствующих проб (комплементарных молекул ДНК)

Приложение Д

Регуляция работы генов. Один ген - один белок.

Наши тела содержат тысячи разных белков, выполняющих разные задачи. К белкам относятся и пищеварительные ферменты, и гормоны, и антитела, защищающие нас от болезней. Информация, необходимая для сборки конкретного белка закодирована в ДНК. Участок ДНК, несущий код конкретного белка, называется геном. Совокупность всех генов человека (это более 100 000 генов) называется геном. Каждый ген кодирует уникальный белок, по принципу один ген – один белок. Ген, который кодирует пищеварительный фермент в составе слюны, отличается от гена, кодирующего антитело или пигмент, окрашивающий глаза.

Организмы регулируют экспрессию генов и в конечном итоге количество и виды белков, содержащихся в клетке. Работа генов все время меняется по множеству причин: при развитии, специализации клетки, для приспособления к условиям окружающей среды. Регуляция работы генов не только позволяет адаптироваться к меняющим условиям, но и препятствует выработке ненужных в данный момент белков, чтобы не тратить на это ресурсы. Лишние затраты ставят клетку в невыгодное положение относительно других. Гены, вовлеченные в транспорт и переработку (катаболизм) пищи, являются хорошими примерами генов со сложной регуляцией. Например, сахар арабиноза может быть использован E. coli в качестве источника энергии и углерода. Бактерии производят три белка, фермента, необходимых для переработки арабинозы. Гены, кодирующие эти белки, не экспрессируются в отсутствие арабинозы, но начинают работать, когда арабиноза появляется в окружающей среде. Как так получается?

Регуляция экспрессии белков обычно протекает на стадии транскрипции, когда на молекуле ДНК синтезируется РНК. Регуляция происходит в специальном участке на матрице ДНК, называемом промотором, где РНК-полимераза связывается с ДНК и начинает транскрипцию. У бактерий связанные по функции гены часто расположены рядом друг с другом и транскрибируются с одного промотора. Такие группы генов, управляемые одним промотором, называются оперонами.

Три гена (araB, araC, araD) кодирующие три фермента, вовлеченных в распад арабинозы, собраны у E. coli вместе в так называемый арабинозный оперон³. Транскрипция этих трех генов начинается с одного промотора, (P_BAD). Для начала транскрипции необходимо присутствие матрицы ДНК, РНК полимеразы, белка AraC и арабинозы. AraC связывается с ДНК в месте посадки РНК-полимеразы перед началом оперона. Когда арабиноза появляется в окружающей среде, бактерии траспортируют ее внутрь. Попав в клетку, арабиноза непосредственно взаимодействует с AraC, связанным с ДНК. Это взаимодействие заставляет AraC изменить свою конформацию (форму) так, что он помогает РНК-полимеразе связаться с ДНК и начинается транскрипция трех генов, A, B и D. Три фермента производятся, выполняют свою работу, и, предположим, через какое-то время арабиноза заканчивается. Тогда AraC изменяет конформацию обратно и транскрипция выключается.

Плазмида pGLO была создана так, чтобы включить в себя некоторые участки арабинозного оперона. В ней присутствуют промотор P_BAD и ген araC, а гены, кодирующие белки, отвечающие за разложение арабинозы (A, B и D) заменены на один ген зеленого флуоресцентного белка (GFP). Таким образом, в присутствии арабинозы, AraC способствует связыванию РНК-полимеразы с промотором и идет транскрипция GFP. По мере накопления белка, клетки начинают флуоресцировать ярко-зеленым. Если арабинозы в среде нет, AraC не облегчает связывание РНК-полимеразы и ген GFP не транскрибируется. Когда GFP не производится, клетки имеют дикий фенотип - они белые и не флуоресцируют под ультрафиолетом.

Все вышесказанное является примером центральной догмы молекулярной биологии в действии: ДНК->РНК->БЕЛОК->ПРИЗНАК

Приложение Е

Ссылки

1. Hanahan, Douglas, Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol.

Biol., 166, 557 (1983).

2. Hanahan, Douglas, Techniques for transformation of E. coli. In DNA Cloning: A Practical

Approach (Ed. D. M. Glover), vol. 1. IRL Press, Oxford (1987).

3. Schleif, Robert,Two positively regulated systems, ara and mal, In Escherichia coli and

Salmonella, Cellular and Molecular Biology, Neidhardt. ASM Press, Washington, D.C.

(1996).

66