104 Трансформантов/мкг

Теперь предположим, ученые нашли, что эффективность трансформации составляет 5,000 трансформантов на мкг. Это будет записываться так:

5∙10³ трансформантов/мкг (5 умножить на 1000)

Как записать в научном виде 40 000 трансформантов/мкг?

4∙10⁴

Последний пример: если эффективность трансформации составила 2600 трансформантов на мкг, это будет записано как:

2.6∙10³ трансформантов/мкг (2.6 умножить 1000)

Аналогично:

5 600=5.6∙10³

271 000=2.71∙10⁵

2 420 000=2.42∙10⁶

Как записать в научном виде 960 000 трансформантов на мкг?

9.6∙10⁵

Запишите вашу рассчитанную эффективность трансформации в стандартном виде:

1.2∙103 Трансформантов/мкг

Опишите одним-двумя предложениями, что означает понятие эффективность трансформации.

Эффективность трансформации – это количественный показатель того, насколько хорошо плазмида проникает в клетки. Это число равняется количеству выросших колоний трансформантов на микрограмм добавленной к клеткам ДНК.

Известно, что эффективность, которая обычно достигается при использовании нашего протокола – от 8∙10² до 7∙10³ трансформантов на мкг ДНК.

Как эффективность трансформации, которую вы получили, соотносится с этими цифрами?

Рассчитанная эффективность трансформации (1.2∙10³ трансформантов на мкг) находится в пределах стандартных значений для данного протокола.

В таблице ниже, запишите значения эффективности трансформации, полученной другими парами из вашего класса:

Пара	Значение эффективности трансформации
Значения будут разными.

Как соотносится ваше и их значения?

Ответы будут разными.

Рассчитайте эффективность трансформации в следующем эксперименте, используя предоставленные значения:

Концентрация плазмиды – 0.08 мкг/мкл

250 мкл раствора CaCl₂

10 мкл раствора плазмиды

250 мкл питательной среды

100 мкл суспензии было растерто по чашке

227 колоний было насчитано

Заполните таблицу и покажите ваш расчет учителю:

Число колоний на чашке LB/amp/ara	227
Количество микрограмм ДНК на одну чашку	0.16
Эффективность трансформации	1.4∙103

Дополнительное задание:

Если в каком-то эксперименте была получена эффективность трансформации 3∙10³, сколько колоний выросло на чашке? Примите концентрацию ДНК и долю ДНК, приходящуюся на одну чашку такими же, как в вашей работе.

Эффективность трансформации=число колоний на чашке/ДНК на чашке (мкг)

3∙10³=X/0.16

X=3∙10³∙0.16

X=480

На чашке вырастет 480 колоний

Руководство для учеников

Трансформация клеток плазмидой pGLO

Урок 1 Введение в трансформацию

В этой лабораторной работе вы будете выполнять генетическую трансформацию бактерий. Ген – это кусочек ДНК, который содержит в себе инструкции как сделать определенный белок (кодирует белок). Этот белок наделяет организм каким-либо признаком. Генетическая трансформация буквально означает «изменение, вызванное генами» и выражается в помещении нового гена в организм, для того, чтобы изменить признаки этого организма. Генетическая трансформация используется во многих областях биотехнологии: в сельском хозяйстве для введения генов устойчивости к морозам, вредителям или гниению в растения, при восстановлении почв, когда в бактерии помещают ген, позволяющий им разлагать нефтяные пятна, наконец, в медицине, когда наследственные заболевания, вызванные дефектными генами, начинают лечить с помощью генной терапии, то есть трансформации больных клеток здоровыми генами.

Вы будете трансформировать бактерии геном, кодирующим зеленый флуоресцентный белок (Green Fluorescent Protein, GFP). Этот ген исходно выделен из биолюминисцентного организма – медузы Aequorea victoria. Б лагодаря зеленому флуоресцентному белку, медуза флуоресцирует и светится в темноте. Пройдя через процедуру трансформации, бактерии экспрессируют приобретенный ген медузы и производят белок, благодаря которому начинают светиться ярко-зеленым под ультрафиолетом.

В этой работе вы узнаете о процессе перемещения генов из одного организма в другой с помощью плазмид. Плазмиды –это маленькие кольцевые молекулы ДНК, которые часто содержатся в клетках бактерий в дополнение к их основным хромосомам. Плазмиды обычно дают бактериям какие-то полезные для выживания признаки. В природе плазмиды быстро передаются от одной бактерии к другой, благодаря чему бактерии обмениваются «полезными» признаками и приспосабливаются к новой среде обитания. Например, возрастающая устойчивость бактерий к антибиотикам во многом связана с перемещением плазмид.

Плазмида pGLO кодирует гены зеленого флуоресцентного белка и белка, дающего устойчивость к антибиотику ампициллину – бета-лактамазы. pGLO также содержит специальную систему регуляции работы генов, которая контролирует экспрессию GFP в трансформированных клетках. Ген GFP можно «включить», добавив в питательную среду, на которой растут клетки, сахар арабинозу. Отбор трансформированных клеток, получивших плазмиду, осуществляется с помощью выращивания на чашках, содержащих ампициллин. Трансформированные клетки будут белыми на чашках, не содержащих арабинозу и будут зелеными под УФ-светом на чашках с арабинозой.

Вопросы к уроку 1

Так как научные исследования направлены на то, чтобы получить ответ на конкретный вопрос, нашим первым шагом может быть формулировка такого вопроса.

Соображение 1: могу ли я генетически изменить организм? Какой организм?

1. Чтобы генетически трансформировать целый организм, вы должны вставить новый ген (гены) в каждую клетку этого организма. Какой организм лучше подойдет для тотальной трансформации – многоклеточный или одноклеточный?

2. Ученые обычно хотят знать, может ли трансформированный организм передать свои признаки потомству, закрепятся ли они в ряду поколений. Чтобы узнать это, какой бы вы выбрали организм, который размножается и дает потомство быстро, или развивается более медленно?

1. Безопасность также важна при выборе экспериментального организма. Какими характеристиками, по вашему мнению, должен обладать организм, чтобы быть уверенным в том, что он не навредит вам или окружающей среде?

2. Опираясь на эти соображения, какой из перечисленных организмов лучше всего подойдет для трансформации: бактерия, дождевой червь, рыба или мышь? Аргументируйте ваш ответ

Соображение 2: как я могу убедиться в том, что клетки генетически трансформированы?

5. Вспомните, что конечной целью генетической трансформации является изменение внешних признаков организма, так называемого фенотипа. Чтобы заметить какие-либо изменения фенотипа, надо сперва тщательно изучить признаки организма до трансформации. Посмотрите на колонии E. coli на ваших чашках и запишите все наблюдаемые внешние признаки, такие как:

а. Число колоний

б. Размер колонии: самой большой

самой маленькой

большинства колоний

в. Цвет колоний

г. Распределение колоний по чашке

д. Внешний вид колоний под ультрафиолетом

е. Способность клеток жить и размножаться в присутствии антибиотика, такого как ампициллин

6. Как вы могли бы с помощью двух чашек c LB-агаром, E. coli и ампициллина определить оказывает ли ампициллин эффект на рост на E. coli?

7.Как вы думаете, что ваши экспериментальные данные скажут о действии ампициллина на E. coli?

Соображение 3: гены

Г енетическая трансформация предполагает внедрение новой ДНК в клетки E. coli. В дополнение к основной хромосоме, клетки бактерий часто содержат одну или несколько маленьких кольцевых молекул ДНК, называемых плазмидами. Плазмидная ДНК обычно содержит гены, отвечающие за несколько признаков. Ученые используют методы генетической инженерии для того, чтобы вставить в плазмиду гены, кодирующие новые признаки. В данном случае, в плазмиду pGLO был вставлен ген зеленого флуоресцентного белка и ген bla, кодирующий белок бета-лактамазу – фермент, разрушающий антибиотик ампициллин и дающий клеткам устойчивость к этому антибиотику. Генетически модифицированная плазмида может быть использована для проведения трансформации клеток, чтобы передать им новый признак.

Соображение 4: процедура трансформации

Процедура трансформации состоит из трех шагов. Эти шаги направлены на то, чтобы внедрить плазмидную ДНК в клетки E. coli и дать возможность клеткам экспрессировать приобретенные гены.

Чтобы переместить плазмидную ДНК через мембрану, вы:

1. Используйте трансформационный раствор (раствор CaCl₂)

2. Выполните процедуру теплового шока

Чтобы трансформированные клетки могли расти в присутствии ампициллина, вы должны:

3. Предоставить им питательные вещества и дать немного времени, для того, чтобы приобретенные гены начали работать.

Урок 2 Лабораторная работа по трансформации

Урок 2 Эксперимент по трансформации
Рабочие места учеников	Число/на пару
Стартовая чашка E. coli (LB)	1
Залитые чашки (1 LB, 2 LB/amp, 1 LB/amp/ara)	Набор из 4
Микробиологические петли	7 (1 упаковка из 10)
Среда LB (аликвота)	1
Раствор для трансформации (аликвота)	1
Пипетки	5
Контейнер со льдом/снегом	1
Фломастер	1
Микроцентрифужные пробирки	2
Плавающий штатив для микроцентрифужных пробирок	1
Рабочее место учителя
Раствор плазмиды pGLO	1
Установленная на 42ºС водяная баня с термометром, или аналог (пенопластовая коробка с водой, нагретой до 42ºС)	1
Термостат на 37ºС (необязательно)	1
Микропипетки на 2-20 мкл и наконечники к ним (необязательно)	1
УФ-лампа	1

Процедура трансформации

1. В озьмите две закрытые микроцентрифужные пробирки. Напишите на одной микроцентрифужной пробирке +pGLO, на другой –pGLO, а также ваш класс и фамилию. Поставьте пробирки в штатив.

2. Откройте пробирки и чистой одноразовой пипеткой добавьте по 250 мкл раствора для трансформации (CaCl₂) в каждую пробирку.

3. Поставьте пробирки на лед

4. С помощью стерильной петли, возьмите 2-4 крупных колонии с вашей «стартовой» чашки. Важно выбирать именно отдельные колонии, так как для успеха трансформации клетки должны активно расти. Возьмите пробирку «+pGLO» и погрузите петлю в трансформационный раствор на дне пробирки. Покрутите петлю между большим и указательным пальцами, чтобы вся колония равномерно размешалась в буфере (без плавающих комков). Поставьте пробирку обратно на лед. Возьмите новую петлю и повторите процедуру для пробирки «-pGLO»

5. Р ассмотрите раствор плазмиды pGLO под ультрафиолетом. Запишите ваши наблюдения. Окуните новую стерильную петлю в раствор плазмиды. Выньте петлю. На кольце должна быть натянута пленка плазмиды (как пленка мыльного раствора на кольце, когда вы выдуваете пузыри). Помешайте петлей суспензию клеток в пробирке «+pGLO». (если у вас есть микропипетка, добавьте 10 мкл раствора плазмиды микропипеткой и перемешайте). Закройте пробирку и верните ее обратно на лед. Не добавляйте ДНК в пробирку «-pGLO».- это контроль.

Д ержите пробирки на льду в течение 10 минут. Убедитесь в том, что вы засунули пробирки достаточно глубоко в штатив, так что их нижняя часть погружена в лед.

6. Пока пробирки стоят на льду, подпишите ваши четыре чашки на нижней стороне (не на крышке) как показано на картинке, т.е.:

обозначьте одну чашку LB/amp «+pGLO», другую – «-pGLO». Обозначьте чашку LB без антибиотика – «-pGLO» и чашку LB/amp/ara – «+pGLO»

7. Т епловой шок. Возьмите штатив с пробирками и быстро перенесите его изо льда на нагретую до 42ºС водяную баню РОВНО на 50 секунд. Убедитесь, что пробирки погружены в воду. Как только 50 секунд пройдут, поставьте штатив обратно на лед. Для хороших результатов важно быстро переместить пробирки изо льда (0ºС) на водяную баню (42ºС) и потом обратно на лед (0ºС). Подержите пробирки на льду две минуты.

8. Снимите штатив со льда и поставьте на стол. Откройте первую пробирку, возьмите чистую стерильную пипетку и добавьте 250 мкл питательной среды LB в пробирку. Снова закройте ее. Повторите процедуру для второй пробирки, обязательно взяв новую стерильную пипетку. Перемешайте суспензию и оставьте на 10 мин на столе.

9. Легко встряхните пробирки пальцем, чтобы перемешать. Нанесите по 100 мкл суспензии из каждой на чашки, в соответствии с рисунком. Используйте новую стерильную пипетку для каждой пробирки. Сразу же закрывайте чашки, чтобы минимизировать загрязнение. Не держите чашки открытыми!

10. Откройте первую чашку и быстро размажьте суспензию по поверхности чашки с помощью стерильной петли. Не нажимайте сильно на петлю, водите ее легко по поверхности, чтобы не поцарапать агар. Сразу же закройте чашку, чтобы минимизировать загрязнение и переходите к следующей чашке. Используйте новую стерильную петлю для каждой чашки.

11. Сложите ваши чашки в стопку и склейте вместе скотчем. Напишите на дне нижней чашки ваши фамилии и класс, переверните стопку, чтобы образующийся на крышке конденсат не капал на поверхность агара, и поставьте в термостат/оставьте на столе.

Вопросы к уроку 2

1. На какой из засеянных чашек вы ожидаете увидеть бактерий, наиболее похожих на исходные колонии, которые вы брали для трансформации? Объясните ваш ответ

2. На какой чашке (чашках) вы ожидаете найти трансформированные клетки, если такие будут?

3. Какие чашки нужно сравнивать между собой, для того, чтобы определить насколько удалась трансформация? Почему?

4. Что означает понятие «контрольная чашка»? Для чего нужен контроль?

Урок 3 Сбор и анализ данных

А. Сбор данных

Посмотрите внимательно на свои чашки при дневном свете. Затем выключите свет и посмотрите на чашки под ультрафиолетом.

1. Внимательно посмотрите и зарисуйте то, что вы видите на каждой чашке. Поместите рисунки в таблицу внизу. Запишите ваши данные, чтобы иметь возможность сравнить трансформированных бактерий (+pGLO) с нетрансформированными контрольными (-pGLO). Вы можете также сфотографировать чашки и поместить фотографии в ваш протокол. Запишите нижеследующие наблюдения для каждой чашки:

2. Сравните рост бактерий на чашках

3. Какого цвета колонии бактерий?

4. Сосчитайте число колоний на каждой чашке (число отдельных точек)

Б. Анализ результатов

Цель анализа результатов этого эксперимента – определить, произошла ли трансформация.

5. Какие из первоначальных признаков, которые вы выделили у E. coli не изменились в результате трансформации? В пространстве внизу перечислите эти признаки и как вы пришли к этим выводам (результаты наблюдений)

Признак	Анализ наблюдений

6. Какие из признаков E. coli изменились в результате трансформации? Перечислите эти признаки и результаты наблюдений, из которых вы сделали ваши выводы.

Признак

Анализ наблюдений

7. Если генетически трансформированные клетки приобрели устойчивость к антибиотику ампициллину, что можно предположить о генах ,находящихся на плазмиде?

8. Как исходя из ваших результатов вы можете заключить, что наблюдаемые вами изменения являются следствием проведенной вами процедуры?

Вопросы к уроку 3

1. Что светится?

Вспомните, что вы наблюдали,когда смотрели на ДНК pGLO под ультрафиолетом. Опишите ваши наблюдения.

2. Какие два возможных источника флуоресценции можно теперь исключить?

3. Что говорит это наблюдение о возможном источнике флуоресценции?

4. Была ли ваша попытка генетической трансформации удачной или неудачной? Аргументируйте ваш ответ.

Посмотрите на ваши четыре чашки. Вы видите рост бактерий на чашках LB, не содержащих ампициллин и арабинозу?

5. Можете ли вы сказать, глядя на чашку LB, являются ли растущими на ней бактерии устойчивыми к ампициллину?

6. Как вы измените условия выращивания бактерий, чтобы выяснить, устойчивы ли они к ампициллину?

7. Часто внешние признаки организма являются проявлением взаимодействия генов с конкретными условиями окружающей среды. Подумайте про зеленый цвет колоний некоторых трансформированных бактерий:

А. Какие два фактора необходимы, чтобы увидеть зеленый цвет? (подсказка: один фактор присутствует на чашке ,второй – как вы смотрите на чашки)

Б. Как вы думаете, как работает каждый из этих двух факторов?

В. Какое преимущество дает организму способность включать или выключать свои гены в зависимости от определенных внешних условий?

Дополнительно: расчет эффективности трансформации

Вашей следующей задачей будет выяснить количественно насколько успешно вы трансформировали E. coli. Такая количественная оценка называется эффективностью трансформации.

Во многих экспериментах необходимо трансформировать как можно больше клеток. Например, при некоторых видах генной терапии у пациента забирают его клетки, трансформируют здоровыми генами в лаборатории ,и имплантируют обратно. Чем больше клеток было трансформировано и стало способно вырабатывать нужный белок, тем лучше. Для того, чтобы определить насколько хорошо идет трансформация, рассчитывают эффективность трансформации.

Эффективность трансформации оценивается как общее число трансформированных клеток, деленное на количество ДНК ,использованное для трансформации (число транформированных клеток на микрограмм ДНК)

Общее число колоний на чашке

Количество ДНК нанесенное на чашку (мкг)

Эффективность трансформации=

Как следствие, для того, чтобы посчитать эффективность, вам надо знать две вещи: количество колоний на чашке (например на чашке LB/amp/ara) и количество ДНК, приходящееся на одну чашку (в микрограммах)