2. Теоретические моменты

Питательная среда

Жидкая и агаризованная среда LB (Лурия-Бертани) сделана из дрожжевого экстракта и гидролизата мясных субпродуктов и представляет собой смесь углеводов, аминокислот, нуклеотидов, солей и витаминов, необходимых для роста бактерий. Агар, который производится из водорослей, расплавляется при нагревании, а когда остывает, образует твердый гель, напоминающий желе. Он функционирует в качестве подложки, на которой растут бактерии

Отбор на устойчивость к антибиотикам

Плазмида pGLO, содержащая ген зеленого флуоресцентного белка, также содержит ген бета-лактамазы, фермента, дающего бактериям устойчивость к антибиотику ампициллину. Бета-лактамаза производится и выбрасывается наружу бактериями, содержащими плазмиду. Секретированная бета-лактамаза инактивирует ампициллин, что позволяет только трансформированным клеткам расти в его присутствии

Трансформационный раствор

Считается, что двувалентные катионы (Ca²⁺) в составе трансформационного раствора (50 mM CaCl₂, pH 6.1) нейтрализуют взаимно отталкивающие отрицательные заряды фосфатных групп ДНК и фосфолипидов клеточной мембраны, что позволяет ДНК легче входить в клетки.

Тепловой шок

Тепловой шок повышает проницаемость клеточной мембраны для ДНК. Точный механизм этого явления не известен, однако для каждого используемого штамма бактерий и условий трансформации подбирается оптимальное время теплового шока.

Период восстановления

10-минутный период восстановления, следующий за добавлением среды LB, необходим клеткам, чтобы оправиться от шока и начать экспрессировать ген устойчивости к ампициллину, бета-лактамазу, необходимый для того, чтобы трансформированные клетки смогли выживать на чашках с антибиотиком.

Можно инкубировать клетки дольше, от часа до 16 ч при 37ºС или при комнатной температуре; это более чем в 10 раз увеличит эффективность трансформации. Не забывайте периодически перемешивать клетки в пробирке, чтобы они не оседали на дно.

Регуляция работы генов в плазмиде pGLO

Работа генов у всех живых организмов тщательно регулируется, чтобы оптимально приспосабливать обмен веществ к постоянно меняющимся условиям окружающей среды и не допускать излишнего производства ненужных в данный момент белков. Хорошими примерами являются гены, отвечающие за поглощение и переработку пищи. Например, сахар арабиноза может быть использована бактериями в качестве источника энергии и углерода. Если арабинозы в окружающей среде нет, ферменты, отвечающие за ее переработку в клетке не производятся, соответствующие гены молчат. Белки, необходимые для катаболизма арабинозы начинают синтезироваться только при наличии этого сахара в среде. Когда она «съедается» и заканчивается, гены вновь выключаются.

Арабиноза стимулирует транскрипцию этих генов, обеспечивая связывание РНК-полимеразы с промотором. В плазмиде pGLO часть генов, ответственных за использование арабинозы, была заменена геном медузы, кодирующим зеленый флуоресцентный белок. Когда бактерии, содержащие плазмиду pGLO, растут в присутствии арабинозы, ген GFP «включается» и бактерии светятся ярко-зеленым под УФ. Это прекрасный пример действия центральной догмы молекулярной биологии: ДНК->РНК->БЕЛОК->ПРИЗНАК. Когда арабинозы в среде нет, ген GFP остается молчащим, и колонии вырастают белыми.

См. приложение D для более детального описания того, как арабиноза регулирует экспрессию зеленого флуоресцентного белка.

Рис 1. Схема плазмиды pGLO

Общий план подготовки для учителей

В этой секции приведен рекомендуемый план подготовки для учителей.

Что нужно сделать	Когда	Сколько потребуется времени
Прочитать руководство. Сделать копии руководства для учеников для каждого ученика	Немедленно	1 час
Приготовить чашки с агаром	За 3-7 дней до начала работы	1 час
Подготовить «стартовые» чашки и аликвоты растворов	За 24-36 ч до начала работы	30 мин
Подготовить рабочие места	Перед началом урока	10 минут

Контрольный список () для ежедневной подготовки рабочих мест

Рабочие места учеников

Ниже приведены приборы и расходные материалы, которые должны быть на каждом рабочем месте перед началом каждой экспериментальной работы. Компонентов в составе этого набора достаточно для снабжения 8 рабочих мест.

Рабочее место учителя (общее)

Список расходных материалов и оборудования, которые должны лежать в общем месте, доступном всем ученикам, также приведен ниже. На усмотрение учителя решать, будут ли ученики иметь доступ к общим буферным растворам и оборудованию, или он сам будет отливать требуемые количества растворов и работать с оборудованием.

Урок 2 Эксперимент по трансформации
Рабочие места учеников	Число/на пару
Стартовая чашка E. coli (LB)	1
Залитые чашки (1 LB, 2 LB/amp, 1 LB/amp/ara)	Набор из 4
Микробиологические петли	7 (1 упаковка из 10)
Среда LB (аликвота)	1
Раствор для трансформации (аликвота)	1
Пипетки	5
Контейнер со льдом/снегом	1
Фломастер	1
Микроцентрифужные пробирки	2
Плавающий штатив для микроцентрифужных пробирок	1
Рабочее место учителя
Раствор плазмиды pGLO	1
Установленная на 42ºС водяная баня с термометром, или аналог (пенопластовая коробка с водой, нагретой до 42ºС)	1
Термостат на 37ºС (необязательно)	1
Микропипетки на 2-20 мкл и наконечники к ним (необязательно)	1
УФ-лампа	1

Урок 3 Анализ полученных результатов
Рабочие места учеников	Число/на пару
Инкубированные чашки с трансформантами и контрольная чашка: LB LB/amp LB/amp/ara	Набор из четырех 1 2 1
Рабочее место учителя
УФ-лампа	1-8

Подготовка к занятиям

Что нужно сделать	Когда	Сколько потребуется времени
Залить чашки с агаром	За 3-7 дней до начала работы	1 час
Растворить E. coli Посеять «стартовые» чашки Растворить плазмидную ДНК pGLO	За 24-36 часов	2 мин 15 мин 2 мин
Приготовить аликвоты растворов Приготовить рабочие места	Перед занятием	10 мин 10 мин

Шаг 1: 3-7 дней до начала работы