Набор по трансформации бактерий плазмидой pGlo

Медуза прольет свет на предмет

То, что в молекулярной биологии многие процессы и события невозможно увидеть, часто представляет проблему для тех, кто только начинает ее изучать. Существует решение проблемы: ген выделенный из биолюминисцентной медузы, кодирующий зеленый флуоресцентный белок (Green fluorescent protein, GFP). Под ультрафиолетом этот белок светится ярким зеленым светом.

Ген, кодирующий GFP, был первоначально выделен из морского организма, медузы Aequorea victoria. Этот ген был дополнительно модифицирован, в последовательность ДНК были внесены мутации, значительно усиливающие флуоресценцию белка. Именно такой ген был встроен в плазмиду pGLO, входящую в этот набор.

GFP невероятно яркий. Трансформируя бактерий pGLO, ваши ученики смогут наблюдать за экспрессией гена практически в реальном времени при помощи карманной УФ-лампы. Затем, с помощью набора для выделения GFP, ваши ученики смогут выделить белок из клеток.

Исследование под нашим руководством

Задача этого учебного курса – провести учеников через мыслительный процесс, необходимый для любого научного эксперимента. Важен не столько сам результат, сколько как этот результат был получен и как он может быть подкреплен тщательными наблюдениями и анализом собранных данных.

На каждом шаге проверяется, насколько ученики понимают происходящее и способны анализировать данные. Вместо того, чтобы предоставлять ученикам готовые объяснения или интерпретации, в руководстве задаются наводящие вопросы, чтобы заставить учеников самих обдумывать все аспекты исследования. Ответы на эти вопросы приведены в конце руководства для преподавателей.

Вовлечение учеников в процесс позволяет им проникнуть в суть научного подхода и научиться организованным и логическим образом решать задачи. У учеников, выполнивших лабораторную работу, возникает чувство понимания научных методов.

Этот набор очень хорошо зарекомендовал себя во всем мире. Мы приветствуем ваши комментарии и предложения.

Содержание

Руководство для преподавателей 4

Введение в трансформацию 4

Контрольный список() содержания набора 6

План уроков 7

Вопросы безопасности 7

Важные моменты работы 8

Общий план подготовки для учителей 13

Шаг 1: 3-7 дней до начала работы 15

Шаг 2: 24-36 ч до начала работы 18

Шаг 3: непосредственно перед началом работы 20

Лабораторный протокол в картинках 21

Ответы на вопросы 23

Вопросы к уроку 1 23

Вопросы к уроку 2 24

Урок 3 Сбор и анализ данных 25

Вопросы к уроку 3 27

Дополнительно: подсчет эффективности трансформации 29

Руководство для учеников 33

Урок 1 Введение в трансформацию 34

Урок 2 Лабораторная работа по трансформации 37

Урок 3 Сбор и анализ данных 42

Дополнительно: расчет эффективности трансформации 46

Приложение А 51

Приложение Б 55

Приложение В 57

Приложение Г 58

Приложение Д 63

Приложение Е 66

Руководство для преподавателей

Введение в трансформацию

В этой лабораторной работе ваши ученики познакомятся с процедурой генетической трансформации. Трансформация подразумевает, что кусочек чужеродной ДНК попадет в клетку и будет работать в ней, вызывая появление нового признака, который можно легко идентифицировать. Само слово трансформация означает изменение - в данном случае, изменение генетического материала организма путем внесения туда новых генов, для того, чтобы организм получил новые признаки.

Генетическая трансформация широко используется в биотехнологии. В растения встраивают гены, дающие им устойчивость к холоду, засухе или вредителям; в бактерии – гены, позволяющие им разрушать нефтяные пятна. Людей, больных генетическими расстройствами, начинают лечить с помощью генной терапии – это означает, что клетки больного человека, несущие поврежденный ген, трансформируют здоровыми копиями этого гена.

Гены из человеческой, животной или растительной ДНК могут быть помещены в бактерий. Например, можно получить бактерий, несущих ген человеческого инсулина. Выработанный бактериями инсулин можно использовать для лечения генетически обусловленного диабета (при котором повреждены гены, кодирующие инсулин)

Система pGLO

В этой работе ваши ученики с помощью простой процедуры трансформируют бактерий геном, кодирующим зеленый флуоресцентный белок (GFP). В природе этот ген принадлежит медузе Aequorea victoria; GFP дает ей возможность флуоресцировать и светиться в темноте. После трансформации бактерии начинают экспрессировать полученный от медузы ген и производить GFP, в результате чего приобретают возможность светиться ярко-зеленым светом под ультрафиолетом.

Ученики познакомятся с процессом переноса генов из одного организма в другой с помощью плазмид. В дополнение к своей хромосомной ДНК, бактерии часто содержат одну или несколько маленьких кольцевых молекул ДНК, называемых плазмидами. Обычно плазмиды содержат гены, тем или иным образом способствующие выживанию бактерий. Бактерии передают плазмиды, содержащие эти гены, друг другу, что позволяет им быстро приспосабливаться к новым условиям. Например, широкое распространение устойчивости к антибиотикам в последнее время во многом связано с перемещением плазмид.

Плазмида pGLO содержит ген GFP и ген устойчивости к антибиотику ампициллину. Также эта плазмида содержит специальную систему регуляции работы генов, с помощью которой можно контролировать экспрессию белка в трансформированных клетках (подробно описана в приложении D). Чтобы «включить» ген GFP, нужно всего лишь добавить сахар арабинозу в питательную среду, на которой растут клетки. Отбор бактерий, получивших ДНК pGLO, ведется с помощью высевания на среду, содержающую антибиотик – ампициллин. Трансформированные клетки вырастают в виде белых колоний на чашках, не содержащих арабинозу, и в виде зеленых – на чашках, где в среду была добавлена арабиноза. За всем процессом можно наблюдать своими глазами с помощью УФ-лампы или УФ-ручки, находящейся в составе этого набора.

Для того, чтобы эта работа принесла наибольшую пользу вашим ученикам, они должны знать, что такое ген и понимать взаимосвязь между генами и белками. Более подробное обсуждение этой и других основных концепций молекулярной биологии вы сможете найти в приложении B.

Данная работа по трансформации может быть продолжена работой по выделению зеленого флуоресцентного белка. Для проведения последней, необходимо сначала провести трансформацию.

Контрольный список() содержания набора

В этом разделе перечислены все компоненты, входящие в состав набора по трансформации бактерий и требуемые дополнительные принадлежности. Каждый набор рассчитан на восемь рабочих мест для учеников. Проверьте с помощью этого списка, все ли у вас есть, перед тем как начать работу.

Компоненты в составе набора	Число/на один набор	()
Штамм E. coli K-12 HB101, лиофилизованный	1 флакон	
Плазмида pGLO, лиофилизованная, 20 мкг	1 флакон	
Ампициллин, лиофилизованный (30 мг)	1 флакон	
L(+)- арабиноза, лиофилизованная (600 мг)	1 флакон	
Раствор для трансформации (15 mM CaCl2, pH 6.1), стерильный, 15 мл	1 банка	
Жидкая среда LB, стерильная, 10 мл	1 банка	
Сухая среда LB (на 500 мл среды), 20 г	1 пакет	
Микробиологические петли, 10мкл, упаковки по 10 петель	8 упаковок	
Стерильные пипетки в индивидуальной упаковке	50	
Микроцентрифужные пробирки, 2.0 мл, прозрачные	30	
Культуральные пробирки, 15 мл, стерильные (упаковка 25 шт)	1 упаковка	
Чашки Петри, 60 мм, стерильные, упаковки по 20	2 упаковки	
Цветные микроцентрифужные пробирки, 2 мл	60	
Пенопластовые штативы для пробирок	8	
УФ-ручка	1	
Необходимые дополнительные принадлежности	Число/на набор	()
Часы или таймер, чтобы засечь 50 секунд	1	
Микроволновая печь	1	
Термометр	1	
Колба на 1 литр	1	
Цилиндр на 500 мл	1	
Накрошенный лед, или снег, и контейнеры для льда (подойдут пластиковые или пенопластовые коробки)	1-8	
Хлорка, 10% раствор	10 мл	
Дистиллированная вода, 500 мл	1	
Фломастеры	4-8	
Термостат на 37ºС*	1	
Водяная баня**	1	

*При комнатной температуре для выращивания клеток на чашках потребуется больше времени

**В качестве альтернативы можно налить горячей воды в пенопластовую коробку и остудить воду до 42ºС

План уроков

Каждая из трех частей работы может быть выполнена за 50 минут. Подробный лабораторный протокол можно найти в руководстве для учеников.

Предполагаемое расписание

День 1 Лекция и обсуждение

День 2 Лабораторная работа по трансформации

День 3 Анализ полученных результатов. Дополнительно: подсчет эффективности трансформации

Вопросы безопасности

Штамм Escherichia coli HB101 K-12 входящий в состав этого набора это не патогенный микроорганизм (в отличие от штамма E. coli H157:07 иногда вызывающего пищевые отравления). HB101 K-12 генетически модифицирован так, чтобы расти только на специальной обогащенной среде. Тем не менее, обращение с этим штаммом требует соблюдения стандартных микробиологических процедур. Эти процедуры включают в себя следующее: раз в день или при разлитии биологического материала все рабочие поверхности обеззараживаются; все зараженные жидкие или твердые отходы обеззараживаются перед утилизацией; все ученики и преподаватели должны мыть руки после каждого контакта с содержащего бактерии материалом и перед выходом из лаборатории. Все процедуры должны выполняться аккуратно, чтобы не вызывать возникновения аэрозолей. Для пользования пипеткой должны применяться механические устройства, набирать растворы ртом запрещено. Запрещено есть, пить, курить и пользоваться косметикой в рабочем помещении. Рекомендуется использование защитных очков и перчаток.

При отсутствии автоклава, все растворы и принадлежности (петли и пипетки), входившие в контакт с бактериями, помещаются по меньшей мере на 20 мин в 10% раствор хлорки для стерилизации. Ванночка с таким раствором должна стоять в каждом рабочем помещении. Все использованные петли и пипетки должны быть собраны для стерилизации. Для стерилизации чашек Петри они покрываются сверху 10% раствором хлорки и выдерживаются как минимум час, после этого жидкость выливается в канализацию, а чашки заворачиваются и далее рассматриваются как обычный мусор. При работе с раствором хлорки рекомендуется использование защитных очков.

Ампициллин может вызывать аллергические реакции или раздражение глаз, дыхательных путей и кожи. В случае попадания в глаза, немедленно промойте их большим количеством воды и обратитесь за медицинской помощью. Используйте подходящие средства защиты. Ампициллин является антибиотиком семейства пенициллина, если у кого-то есть аллергия на пенициллин или на другой пенициллиновый антибиотик, он должен избегать контакта с ампициллином.

Более подробную информацию и данные по безопасности (MSDS) для компонентов набора вы можете узнать на сайте компании www.bio-rad.com. Используйте ваши местные законы и нормативы для правильной утилизации отходов.

УФ лампа

Ультрафиолетовое излучение может вызывать ожоги глаз и кожи. Коротковолновое УФ-излучение более опасно, чем длинноволновое. Используйте длинноволновую УФ лампу для этой работы. Если возможно, используйте защитные очки, не пропускающие УФ (обычное кварцевое стекло также задерживает УФ).

Важные моменты работы

В этом разделе описаны важные экспериментальные и теоретические моменты, которые могут представлять трудности для учеников. Эти моменты чрезвычайно важны для успеха всей работы. Преподаватели должны привлечь внимание учеников к этим вопросам, и, когда это возможно, лично демонстрировать технику выполнения экспериментов.

Самым важным является то, чтобы ученики помещали нужные вещества в нужные пробирки и на нужные чашки. Нужно очень четко подписывать пробирки. Хорошая организация всей работы - это ключ к ее успеху. Руководство для учеников содержит подробное иллюстрированное описание всех экспериментальных шагов и процедур для уроков со второго по пятый. Обращайтесь к нему, если вам что-то непонятно в экспериментальных протоколах.