6. Как расшифровывается ифа?

Иммуноферментный анализ

7. Зачем в этом тесте используются ферменты?

С помощью ферментов мы видим, связались ли первичные антитела с антигеном в лунке. Первичные и вторичные антитела не видимы глазом, поэтому необходим какой-то метод их обнаружения. Фермент пероксидаза хрена соединен со вторичными антителами. Реакция с бесцветным субстратом приводит к его окислению с образованием окрашенного в синий цвет вещества. Изменение цвета возможно только если в образце присутствуют вторичные антитела и следовательно указывает на положительный результат теста.

8. Почему в тесте наряду с опытными образцами нужен положительный и отрицательный контроль?

Контроли необходимы для того, чтобы удостовериться, что эксперимент работает. Если у вас нет положительного контроля и ваш образец оказался отрицательным, вы не можете сказать, действительно ли он отрицательный, или просто весь ваш тест по какой-то причине не работает. И наоборот, без отрицательного контроля вы не можете быть уверены в том, что ваш тест не сработал по ошибке и не дал ложноположительный результат.

Вопросы к лабораторной работе

1. Содержал ли ваш образец сыворотки антитела к возбудителю болезни?

Ученики отвечают, основываясь на полученных результатах.

2. Если ваш анализ на антитела положительный, означает ли это, что вы больны?

Положительный результат не обязательно означает, что вы больны.

3. Какие могут быть причины для положительного результата теста, когда вы на самом деле не больны?

Это может быть ложноположительный результат. Не все тесты так уж специфичны к одному возбудителю заболевания. Например, тест на болезнь Лайма, основанный на определении антител IgG и IgM к бактериям, вызывающим болезнь, имеет достоверность 72% и положительные результаты теста должны быть подтверждены более надежным анализом, например, вестерн-блотом. Еще одна причина ложноположительных результатов – когда вы уже болели какой-то болезнью в прошлом. Например, большинство взрослых людей когда-либо сталкивались с вирусом Эпштейна-Барр (причиной многих случаев мононуклеоза) и у некоторых достаточно высокий уровень антител к вирусу в крови поддерживается на протяжении многих лет после первоначальной инфекции. Если они придут к терапевту с жалобой на температуру и больное горло, их анализ на ВЭБ может быть положительным, но это не обязательно означает, что именно ВЭБ вызывает симптомы, на которые они жалуются.

4. Почему вы проводите анализ ваших образцов в трех повторностях?

Проведение анализа в трех повторностях – это еще один контроль. Если вы не получили одинаковый (положительный или отрицательный) результат во всех трех лунках, значит, у вас проблемы с выполнением эксперимента. В клинической лаборатории этот анализ пришлось бы переделывать. В данной лабораторной работе ориентируйтесь на результат в двух совпадающих лунках, так как он скорее является правильным.

5. Что происходит, когда вы добавляете образцы сыворотки в лунки, если эти образцы положительны? Если отрицательны?

Если образец сыворотки положительный, он содержит антитела, которые узнают сорбированный на стенках лунки антиген и связываются с ним. Если образец отрицательный, он не содержит исследуемых антител.

6. Почему необходимо на каждом этапе промывать лунки?

При промывке удаляются все белки несвязавшиеся с лунками, а также все антитела, не связавшиеся со своими антигенами. Если бы несвязавшиеся реагенты оставались в растворе, они могли бы дать ложноположительные результаты.

7. Что происходит, когда вы добавляете вторичные антитела к положительным образцам сыворотки? К отрицательным образцам?

Если образец сыворотки содержит первичные антитела, вторичные антитела связываются с ними. Первичные антитела в свою очередь связаны с антигеном, адсорбированным на стенки лунки. Если образец не содержал первичных антител, то вторичные антитела остаются в растворе и затем удаляются при промывке.

8. Какие основанные на антителах тесты вы можете купить в аптеке?

Тест-системы, основанные на тех же принципах, что и ИФА, это например тесты на беременность и тесты на присутствие наркотиков, таких как кокаин или марихуана.

.

Лабораторный протокол в картинках

Список для проверки рабочих мест. Одно рабочее место рассчитано на 4 учеников

Предмет	Содержимое	Количество	()
Желтые пробирки	Образцы для анализа (0.25 мл)	4 шт (по 1 на ученика)	
Фиолетовая пробирка (+)	Положительный контроль (0.5 мл)	1 шт	
Синяя пробирка (-)	Отрицательный контроль (0.5 мл)	1 шт	
Зеленая пробирка (Антиген)	Очищенный антиген (1.5 мл)	1 шт	
Оранжевая пробирка (В.А.)	Вторичные антитела (1.5 .мл)	1 шт	
Коричневая пробирка (Субстрат)	Субстрат пероксидазы (ТМБ) 1.5 мл	1 шт	
12-луночные стрипы		2 шт	
Микропипетка		1 шт	
Желтые носики для микропипетки		10-20 шт	
Одноразовые пластиковые пипетки		1 шт	
70-80 мл промывочного буфера в стакане	Фосфатно-солевой буфер (PBS), содержащий 0.05% Твин 20	1 шт	
Большая пачка бумажных полотенец		2	
Черный фломастер (маркер)		1 шт	

1. Подпишите желтую микроцентрифужную пробирку вашими инициалами (именем). Возьмите ваш 12-луночный стрип. Подпишите первые три лунки «+» (это будет положительный контроль), следующие три лунки «-» (отрицательный контроль). Следующие шесть лунок предназначаются для вашего опыта и опыта вашего напарника по работе (по три)

2. Чистым носиком добавьте во все лунки по 50 мкл очищенного антигена.

3. Подождите 5 минут, чтобы антиген связался с лунками.

4. ПРОМЫВКА:

А . Переверните стрип, положите его на пачку бумажных полотенец и легонько постучите по дну. Убедитесь, что брызги не попали обратно в лунки.

Б. Выкиньте верхнее полотенце.

В. Чистой пипеткой заполните каждую лунку буфером для промывки, стараясь не переливать его через стенки. Для всех стадий промывки можно использовать одну и ту же одноразовую пипетку.

Г. Опять положите стрип на пачку полотенец и постучите по дну.

Д. Выкиньте 2-3 верхних полотенца (которые промокли).

5. Повторите промывку (шаг 4) еще раз.

6. Чистым носиком перенесите по 50 мкл положительного контроля в первые три («+») лунки.

7. Чистым носиком перенесите по 50 мкл отрицательного контроля в следующие три («-») лунки.

8. Вместе с вашим напарником перенесите по 50 мкл ваших образцов сыворотки в подписанные вашими именами лунки. Обязательно используйте чистый носик для каждого образца!

9. Подождите 5 минут, чтобы антитела могли связаться с антигеном

10. Промойте лунки, повторив процедуру промывки (шаг 9) ДВА раза.

11. Чистым носиком добавьте по 50 мкл раствора вторичных антител во все 12 лунок.

12. Подождите 5 минут, чтобы вторичные антитела могли связаться с первичными.

13. Промойте лунки, повторив процедуру промывки (шаг 4) ТРИ раза.

14. Чистым носиком добавьте по 50 мкл субстрата пероксидазы во все 12 лунок.

15. Подождите 5 минут. Наблюдайте за тем, что получилось, и запишите ваши результаты.

Руководство для учеников

Введение

Вы будете выполнять эксперимент, в котором вы обменяетесь образцами (совершите «контакт») с вашими одноклассниками. После обмена вы проведете иммуноферментный анализ (ИФА), чтобы определить, «заразились» ли вы «болезнью». В ИФА с помощью антител обнаруживается присутствие агента, вызывающего болезнь (например, бактерий, вирусов или паразитов) в крови или другой жидкости из вашего тела (которая симулируется вашими образцами). Затем вы попробуете отследить распространение «болезни» в вашем классе до ее источника.

Когда вы заболеваете, ваш организм вырабатывает иммунный ответ. Молекулы, в ответ на которые вырабатывается иммунный ответ, это чужеродные молекулы, не встречающиеся в норме в вашем организме. Это могут быть части бактерий, вирусов или грибов. Через несколько дней в вашей крови уже циркулируют миллионы антител – белков, которые распознают антигены и прочно связываются с ними. Антитела нейтрализуют токсины и, с помощью других клеток или молекул иммунной системы, уничтожают чужеродные объекты.

Около 100 лет назад биологи обнаружили, что иммунная система животных реагирует на появление «чужеродных объектов», или антигенов. Сейчас антитела являются незаменимым средством, используемым в научных исследованиях, биотехнологии и для диагностики и лечения заболеваний. Число видов различных антител, циркулирующих в крови, по разным оценкам составляет от ¹⁰⁶ до 10¹¹; это означает, что существует антитело практически на любой возможный антиген. Антитела составляют до 15% общего белка вашей сыворотки крови. Антитела необычайно специфичны: каждое из них узнает только свой антиген.

А) Структура иммуноглобулина (антитела) IgG, связанного со своим антигеном – капсидным белком ВИЧ p24, определенная с помощью рентгеноструктурного анализа (Harris et al., 1998, Momany et al., 1996). Эти структуры можно найти в базе данных PDB (Protein Data Bank, www.pdb.ufmg.br (Berman et al., 2000)) по кодам 1IGY и 1AFV и просмотреть на компьютере с помощью бесплатных программ, таких как JMol, Rasmol, Protein Explorer. Б) Распространенное схематичное изображение антитела, связанного с антигеном.

Как делаются антитела?

У ченые научились использовать иммунный ответ животных для того, чтобы производить антитела для диагностики и лечения болезней, а также для научных целей. Наука, изучающая иммунную систему, называется «иммунология». Животным, таким как куры, кролики, козы, овцы, лошади и др. можно ввести антиген (это называется «иммунизацией») и через какое-то время сыворотка «иммунизированных» животных будет содержать антитела к этому антигену. Если антиген имел отношение к агенту, вызывающему болезнь, полученные антитела можно использовать для диагностических тестов на данную болезнь. Антитела, узнающие антиген, в иммунологических тестах называются «первичными» антителами, они придают специфичность тесту. Другие виды антител, в том числе вторичные антитела, делаются таким же образом. Вторичные антитела узнают и связывают первичные антитела, которые являются антителами другого вида животных. Для того, чтобы их получить, животных иммунизируют антителами, полученными из другого вида животных. Они узнаются иммунной системой как чужеродные белки, и на них вырабатываются антитела. Например, для того ,чтобы получить вторичные антитела, узнающие первичные человеческие антитела, человеческие антитела можно ввести в животное, например, в кролика. После того, как у кролика выработается иммунный ответ, его сыворотка будет содержать антитела, которые будут узнавать человеческие антитела и связываться с ними. Вторичные антитела, используемые в данной работе, конъюгированы (ковалентно связаны) с ферментом пероксидазой хрена. Пероксидаза катализирует окисление субстрата, ТМБ, перекисью водорода, в результате чего образуется окрашенный в синий продукт.

Как ИФА используется в реальной жизни?

Благодаря своей быстроте, ИФА нашел широкое применение в сельском хозяйстве и медицине. ИФА используют в тестах на беременность и на наркотики, для диагностирования заболеваний у человека, животных и растений, для тестирования качества воздуха в помещениях и правильности маркировки пищевых продуктов. При появлении новых опасных заболеваний, таких как атипичная пневмония, одной из первых задач является создание быстрых и простых тестов на то, заражен ли пациент вирусом.

Некоторые тесты могут дать положительный или отрицательный результат в течение нескольких минут. Например, домашние тесты на беременность основаны на принципах, очень похожих на ИФА. Они детектируют человеческий хорионный гонадотропин (ХГЧ) – гормон, который появляется в крови и моче беременной женщины через несколько дней после оплодотворения. Ближе к нижнему краю на тестовую полоску нанесены антитела к ХГЧ, связанные с розовым красителем (шаг 1). После того, как нижний край полоски погружается в мочу, жидкость начинает подниматься наверх под действием капиллярной силы, вместе с ней перемещаются и антитела. Если в моче содержится ХГЧ, он связывается с антителами (шаг 2). Когда комплексы достигают первой тестовой зоны, они связываются с антителами к ХГЧ, фиксированными на полоске, и концентрируются в виде розовой полосы (шаг 3). На полоске всегда есть внутренний контроль в виде фиксированных вторичных антител (узнающих антитела к ХГЧ как связанные, так и не связанные с антигеном) (шаг 4). Таким образом, любой работающий тест дает одну розовую полосу, но только при положительном результате теста можно увидеть две полосы.

Иммунный ответ

Когда мы заболеваем, наша иммунная система начинает производить антитела против возбудителей болезни (точнее, против антигенов, которые несут эти возбудители). Обычный иммунный ответ протекает характерным образом. Сначала производится один тип антител, так называемый иммуноглобулин М (IgM). Он может быть обнаружен в крови уже через неделю после инфекции. Приблизительно через три недели после этого уровень IgM в крови падает, и он заменяется другим иммуноглобулином – IgG. Если к тому времени болезнь уже прошла, концентрация IgG в крови быстро падает через несколько дней.

Когда наш организм встречается с той же самой болезнью во второй раз, иммунный ответ гораздо более быстрый и сильный. Это явление лежит в основе вакцинации (вызвать первичный иммунный ответ) и дополнительных бустер-иньекций льных инъелнительных инъекцийммунный ответ) и дополнительных инъекций (тся ложноположительным.ым. ть образцы с заранее извест (вызвать вторичный иммунный ответ). Когда доктор делает вам прививку от гриппа, он вводит вам инактивированный вирус, который не может причинить вреда, но тем не менее способен подготовить вашу иммунную систему к встрече с реальным вирусом.

Контроли в иммунологических тестах

Для того, чтобы любому тесту можно было верить, помимо опытных образцов, он должен обязательно включать в себя контроли, то есть образцы, которые должны дать заранее известные результаты. Опытные и контрольные образцы делаются единовременно. Если у вас нету положительного контроля, а результат анализа отрицательные, как вы можете быть уверены в том ,что он на самом деле отрицательный? Может быть, у вас просто не работает тест? Если положительный образец дает отрицательный результат в тесте, он называется ложноотрицательным. Аналогично, если у вас нет отрицательного контроля, а все результаты теста – положительные, как вы можете быть уверены в том, что они действительно положительные? Может быть, ваш тест был загрязнен антигеном или антителами? Если отрицательный образец дает в тесте положительный результат, он называется ложноположительным.

Зачем нужны контроли?

Положительный и отрицательный контроли являются необходимой частью любого теста. Они позволяют нам убедиться в том, что тест работает корректно. Многие диагностические тесты дают определенный процент ложноположительных или ложноотрицательных результатов, поэтому необходимо подтверждение диагноза другим исследованием. Например, иммуноферментный анализ на антитела к ВИЧ может давать как ложноположительные, так и ложноотрицательные результаты. Ложноположительные могут возникать из-за проведенных недавно вакцинаций, а ложноотрицательные – из-за подавления работы иммунной системы (например, как следствие приема иммунносупрессантов) или из-за того, что тест был проведен слишком рано и антитела в крови еще не появились. (антитела к ВИЧ в крови появляются только спустя несколько недель после заражения; процесс появления антител называется сероконверсией). Поэтому положительные результаты теста на ВИЧ всегда подтверждают вестерн-блотом.

К

Методика вестерн-блоттинга предполагает электрофоретическое разделение белков в геле, перенос разделенных белков на мембрану и последующее окрашивание первичными и вторичными антителами.

онтроли также позволяют выявить экспериментальные ошибки. Могут возникать проблемы с реагентами, которые портятся от времени или от плохих условий хранения. Лаборанты, которые проводят тест, тоже могут взять не те реагенты, сделать ошибки в разведениях, забыть сделать промывку, и.т.п. Ошибки могут возникать и из-за плохого ведения записи результатов. Все эти вещи можно отследить, если включить в тест нужные контроли.

Давайте приступим к работе.

Вопросы до лабораторной работы

1. Как иммунная система защищает нас от болезней?

2. Как доктора используют наш иммунный ответ, чтобы защитить нас от болезней?

3. Приведите пример болезней, атакующих человеческую иммунную систему

4. Какого рода бывают нарушения работы иммунной системы?

5. Почему важно уметь определять антитела в крови людей, которые не выглядят больными?

6. Как расшифровывается ИФА?

7. Зачем в этом тесте используются ферменты?

8. Почему в тесте наряду с опытными образцами нужен положительный и отрицательный контроль?

Основные шаги в тесте ИФА для обнаружения антител:

Шаг 1: Добавить очищенный антиген в лунки плашки.. Подождите 5 минут, чтобы дать возможность молекулам антигена связаться с пластиком плашки.

Шаг 2: добавить в лунки ваши образцы сыворотки вместе с положительным и отрицательным контролями. Если в вашем образце присутствуют антитела против антигена – первичные антитела – они найдут его молекулы среди всех других молекул, и прочно свяжутся с ними.

Шаг 3: добавить соединенные с ферментом – пероксидазой вторичные антитела (антитела на антитела). Если в лунке есть первичные антитела, вторичные антитела свяжутся с ними.

Шаг 4: добавить субстрат пероксидазы, подождать 5 минут, и оценить результаты анализа. Если раствор в лунке станет синим, анализ положительный (в вашем образце присутствуют антитела к данному антигену). Если раствор останется бесцветным, анализ отрицательный.

Лабораторный протокол

Список для проверки рабочих мест. Одно рабочее место рассчитано на 4 учеников

Предмет	Содержимое	Количество	()
Желтые пробирки	Образцы для анализа (0.25 мл)	4 шт (по 1 на ученика)	
Фиолетовая пробирка (+)	Положительный контроль (0.5 мл)	1 шт	
Синяя пробирка (-)	Отрицательный контроль (0.5 мл)	1 шт	
Зеленая пробирка (Антиген)	Очищенный антиген (1.5 мл)	1 шт	
Оранжевая пробирка (В.А.)	Вторичные антитела (1.5 .мл)	1 шт	
Коричневая пробирка (Субстрат)	Субстрат пероксидазы (ТМБ) 1.5 мл	1 шт	
12-луночные стрипы		2 шт	
Микропипетка		1 шт	
Желтые носики для микропипетки		10-20 шт	
Одноразовые пластиковые пипетки		1 шт	
70-80 мл промывочного буфера в стакане	Фосфатно-солевой буфер (PBS), содержащий 0.05% Твин 20	1 шт	
Большая пачка бумажных полотенец		2	
Черный фломастер (маркер)		1 шт	

Выполнение ИФА

1. Подпишите желтую микроцентрифужную пробирку вашими инициалами (именем). Возьмите ваш 12-луночный стрип. Подпишите первые три лунки «+» (это будет положительный контроль), следующие три лунки «-» (отрицательный контроль). Следующие шесть лунок предназначаются для вашего опыта и опыта вашего напарника по работе (по три), подпишите их вашими инициалами. Например, Митя Гиляров и Аня Лопатина подписали бы свои лунки так:

2. Д обавьте чистым носиком по 50 мкл очищенного антигена из зеленой пробирки с надписью «Антиген» в каждую лунку плашки. Подождите 5 минут для связывания антигена.

3. Промывка:

А. Переверните стрип, положите его на пачку бумажных полотенец и легонько постучите по дну. Убедитесь, что брызги не попали обратно в лунки.

Б. Выкиньте верхнее полотенце.

В. Чистой пипеткой заполните каждую лунку буфером для промывки из стакана, стараясь не переливать его через стенки. Для всех стадий промывки можно использовать одну и ту же одноразовую пипетку.

Г. Опять положите стрип на пачку полотенец и постучите по дну.

Д. Выкиньте 2-3 верхних полотенца (которые промокли).

4. Повторите всю процедуру промывки (шаг 3) еще раз.

5. Добавьте контрольный и опытные образцы:

А. Чистым носиком перенесите по 50 мкл положительного контроля из фиолетовой пробирки в первые три («+») лунки.

Б. Чистым носиком перенесите по 50 мкл отрицательного контроля из синей пробирки в следующие три («-») лунки.

В. Вместе с вашим напарником перенесите по 50 мкл ваших образцов в подписанные вашими именами лунки. Обязательно используйте чистый носик для каждого образца!

7. Подождите 5 минут, для того чтобы все белки в составе образца связались с плашкой.

7. Промойте лунки, повторив процедуру промывки ДВА раза.

7. Чистым носиком добавьте по 50 мкл раствора вторичных антител («В.А.») из оранжевой пробирки во все 12 лунок.

7. Подождите 5 минут, чтобы вторичные антитела могли связаться с первичными.

7. Промойте лунки, повторив процедуру промывки ТРИ раза.

7. Чистым носиком добавьте по 50 мкл субстрата пероксидазы («Субстрат») из коричневой пробирки во все 12 лунок.

7. Подождите 5 минут. Наблюдайте за тем, что получилось, и запишите ваши результаты.

Результаты

О бозначьте лунки на картинке так же, как лунки в вашем эксперименте и напишите «+» на тех лунках, которые стали синими и «-» - на тех, которые остались бесцветными.

Результат вашего анализа положительный или отрицательный? Объясните ваш ответ.

Вопросы к лабораторной работе

1. Содержал ли ваш образец сыворотки антитела к возбудителю болезни?

2. Если ваш анализ на антитела положительный, означает ли это, что вы больны?

3. Какие могут быть причины для положительного результата теста, когда вы на самом деле не больны?

4. Почему вы проводите анализ ваших образцов в трех повторностях?

5. Что происходит, когда вы добавляете образцы сыворотки в лунки, если эти образцы положительны? Если отрицательны?

6. Почему необходимо на каждом этапе промывать лунки?

7. Что происходит, когда вы добавляете вторичные антитела к положительным образцам сыворотки? К отрицательным образцам?

8. Какие основанные на антителах тесты вы можете купить в аптеке?

Приложение А: Иммунологические концепции

Иммунитет

Иммунология это наука об иммунной системе. Наш организм защищает себя от инфекций с помощью физических и химических барьеров, циркулирующих в крови антител и клеток иммунитета, которые нейтрализуют или уничтожают все чужеродные вещества и клетки. Некоторые клетки в составе иммунной системы обладают «памятью», то есть способны быстрее реагировать при следующей встрече с тем же самым патогеном.

Каждый человек рождается с врожденным иммунитетом, который обеспечивается макрофагами и «натуральными киллерами» (НК-клетками). Этот вид иммунитета не меняется при контакте с инфекциями и не обладает специфичностью к определенным агентам.

Пассивный иммунитет – это передача антител от внешнего источника, например, ребенку от матери или в результате вакцинации (например, после укуса бешеного животного вводят антитела к вирусу бешенства). Пассивный иммунитет длится всего несколько недель, на протяжении которых в крови сохраняются полученные антитела.

Приобретенный или адаптивный иммунитет – это специфический ответ на специфические чужеродные вещества. Хотя все люди рождаются с потенциальной способностью к иммунному ответу на любое вещество, иммунная система должна быть «активирована» после первого контакта с конкретным веществом. Этот первый контакт, или «иммунизация», запускает каскад событий, позволяющих организму впоследствии давать специфический ответ при контакте с тем же антигеном. Приобретенный иммунитет включает в себя гуморальный иммунитет (синтез антител, которые циркулируют в крови и лимфе и специфично связываются с чужеродными антигенами) и клеточный иммунитет (появление клона Т-лимфоцитов, которые уничтожают чужеродные или инфицированные клетки).

Явление приобретенного иммунитета лежит в основе прививок, которые нам делают в детстве. Еще в 1790-х годах, задолго до какого-либо понимания работы иммунной системы, было открыто, что гной из оспенных пузырьков коров, больных коровьей оспой, предохраняет людей от человеческой оспы. Американский центр по контролю за распространением болезней в настоящее время рекомендует детские прививки от 12 болезней: кори, свинки, краснухи, полиомиелита, дифтерии, столбняка, коклюша, гемофильной инфекции (Haemophilus influenzae тип Б, ХИБ) гепатита Б, ветрянки, гепатита А и пневмококкового менингита. В случае поездок в тропические страны также рекомендуется ряд прививок, например от тифа или желтой лихорадки.

Компоненты приобретенного иммунного ответа

Во время иммунного ответа, появление в теле чужеродных молекул (антигенов) вызывает образование антител B лимфоцитами (B клетками). Каждый B лимфоцит производит один уникальный тип антител, способный узнавать определенный участок на поверхности антигена (эпитоп). Связываясь с антигенами, антитела помогают клеткам иммунной системы (B клеткам, Т клеткам и макрофагам) узнавать и атаковать захватчиков. У каждого из нас, при условии, что у него не нарушен иммунитет, в крови циркулируют антитела и лимфоциты, способные узнать миллионы различных антигенов.

В качестве антигенов могут выступать микроорганизмы (вирусы и бактерии), продукты их жизнедеятельности (токсины, вырабатываемые некоторыми бактериями или белки, находящиеся на поверхности их клеток), чужеродные белки, молекулы ДНК и РНК, лекарства и другие химические соединения.

Антитела (или иммуноглобулины, Ig) – это белки, синтезируемые B клетками. Они могут существовать в виде отдельных молекул, или оставаться прикрепленными к поверхности клеток. Существует пять типов иммуноглобулинов: IgG, IgM, IgA, IgE и IgD. IgG самый распространенный тип антител в организме (Parham), у взрослых он составляет до 15% от общего белка сыворотки крови. Каждая молекула igG способна связать две молекулы антигена. IgM также находится в сыворотке и отвечает за первичный иммунный ответ. IgA находится в выделяемых жидкостях, таких как слезы, слюна, молоко и на слизистых, он представляет из себя первую линию защиты против микроорганизмов. IgA это также единственный вид антител, который может передаваться от матери ребенку. IgD, возможно, задействован в регуляции иммунного ответа, а IgE является основным компонентом аллергических реакций.

А) Структура иммуноглобулина (антитела) IgG, связанного со своим антигеном – капсидным белком ВИЧ p24, определенная с помощью рентгеноструктурного анализа (Harris et al., 1998, Momany et al., 1996). Эти структуры можно найти в базе данных PDB (Protein Data Bank, www.pdb.ufmg.br (Berman et al., 2000)) по кодам 1IGY и 1AFV и просмотреть на компьютере с помощью бесплатных программ, таких как JMol, Rasmol, Protein Explorer. Б) Распространенное схематичное изображение антитела, связанного с антигеном.

Эпитопы это отдельные участки антигена, которые узнаются антителами. Каждое антитело узнает отдельный эпитоп, поэтому разные антитела могут узнавать и связывать разные эпитопы на поверхности одного и того же антигена. Например, частица вируса иммунодефицита человека (вирион) имеет на своей поверхности множество потенциальных эпитопов, которые могут узнаваться разными антителами. Одно антитело может узнавать один конец капсидного белка ВИЧ p24, а другое – другой конец.

Клетки иммунной системы – это ее «солдаты». Макрофаги удаляют чужеродные клетки и молекулы из крови и «процессируют» антигены и экспонируют их на своей поверхности. Экспонированные на поверхности макрофагов эпитопы узнаются Т клетками, которые привлекают другие клетки иммунной системы к месту инфекции, вызывая воспаление. B и Т клетки это лимфоциты (белые кровяные клетки) и каждая из них способна узнавать один определенный эпитоп. Т клетки созревают в тимусе, а B клетки – в костном мозге. B клетки производят антитела; число циркулирующих в крови антител оценивается между 10⁶ и 10¹¹, поэтому всегда найдутся антитела, способные связаться с данным антигеном. Огромное число и разнообразие антител проистекают от рекомбинаций генов, кодирующих антитела, происходящих внутри каждой B клетки. Как и макрофаги, B клетки способны экспонировать антигенные эпитопы на своей поверхности, и привлекать Т клетки. У Т клеток есть две основных функции: они стимулируют размножение B клеток, связавшихся с антигеном, и они убивают клетки, зараженные вирусом, чтобы предотвратить заражение других клеток.

Зачем нам нужна иммунная система?

Даже у бактерий есть аналог иммунной системы: они используют рестрикционные ферменты для уничтожения ДНК вирусов бактерий (бактериофагов), в то же время их собственная ДНК метилирована, т.е. помечена как «своя» и защищена от разрезания. Наша иммунная система работает каждый день, защищая нас от тысяч различных инфекций, но она настолько эффективна, что мы даже не замечаем этого. Болезнь может быть результатом инфекции, генетического дефекта, или токсинов из окружающей среды.

Организмы и молекулы, которые вызывают болезни, называются патогенами – это могут быть бактерии, вирусы, грибы, паразитические простейшие или черви и инфекционные белки – прионы. Инфекционные болезни распространяются разными путями:

Путь распространения инфекции	Примеры
Близкие контакты между людьми: обмен слюной, кровью или другими выделениями	ВИЧ, атипичная пневмония, вирус Эпштейна-Барр, болезни, передающиеся половым путем
Еда	Бактерии, вызывающие пищевые отравления, например E. coli O157:H7, прионы, вызывающие болезнь «коровьего бешенства», паразитические черви
Вода	Возбудители холеры, простейшие (гиардии, вызывающие гиардиоз)
Воздушно-капельный путь (вдыхание)	Возбудители гриппа или туберкулеза
Проникновение через кожу	Паразитические нематоды
Перенос с насекомыми	Малярия, желтая лихорадка, лихорадка Денге, вирус Западного Нила (с комарами) Клещевой энцефалит, болезнь Лайма (клещи) Чума (блохи) Для некоторых болезней, например геморрагической лихорадки Эбола, предполагается наличие переносчиков, но они еще не идентифицированы:

Иммунный ответ

К огда организм в результате вакцинации или в результате естественных процессов сталкивается с чужеродным антигеном, он вырабатывает иммунный ответ, называемый первичным. В течение 1-2 недель наблюдается подъем концентрации антител к данному антигену в крови (этот процесс называется сероконверсией). В основном это антитела типа IgM. Затем их сменяют антитела вида IgG, потом концентрация антител спадает.

Когда тот же человек второй раз сталкивается с тем же антигеном, неважно, через недели или через годы, иммунный ответ сильнее и гораздо быстрее. В течение вторичного ответа, антитела IgM выявляются уже в течение дней после контакта с антигеном, затем их сменяют IgG, которые производятся в большом количестве. Могут производиться и иммуноглобулины других типов. Уровень антител IgG в крови гораздо выше, чем при первичном ответе, и такой уровень может поддерживаться на протяжении месяцев или даже лет.

Проблемы с иммунной системой

Наша иммунная система защищает нас от болезней, но когда она функционирует некорректно, это может вызвать серьезные проблемы со здоровьем. Проблемы с иммунной системой можно разделить на три основные группы: гиперчувствительность, иммунная недостаточность и аутоиммунные болезни.

Реакции гиперчувствительности возникают, когда иммунная система реагирует слишком сильно на какой-то антиген, это может вызвать болезни или даже смерть. Существует четыре типа реакций гиперчувствительности: 1) анафилактические реакции (в целом называемые аллергиями) вызываемые например пыльцой, пылевыми клещами или определенными белками в составе пищи (антиген, вызывающий аллергию, называется аллергеном); 2) цитотоксические реакции, такие как реакции несовместимости при переливания крови; 3) комплексные реакции, например «легкое фермера», болезнь, вызываемая вдыханием спор грибов; и 4) отсроченная гиперчувствительность, например дерматит, который может быть вызван контактом с самыми разными веществами, от косметики до никеля.

Иммунная недостаточность означает, что иммунная система человека не способна эффективно защищать его организм и он подвержен так называемым оппортунистическим (больничным) инфекциям, которые не развиваются у людей с нормальным иммунитетом. Существует два вида иммунной недостаточности. Первичная недостаточность имеет генетическую основу, например тяжелая комбинированная иммунная недостаточность (SCID). Лечением первичной иммунной недостаточности может служить только генная терапия. Вторичная недостаточность возникает вследствие внешних причин и больше распространена. Причинами могут служить заражение ВИЧ, прием иммунносупрессантов, плохое питание, стресс или старение.

Аутоиммунные заболевания возникают, когда иммунная система воспринимает клетки собственного организма как «чужие» и атакует их. Примерами аутоиммунных болезней являются системная красная волчанка (эритематоз), множественный склероз, диабет I типа, ревматоидный артрит, целиакия.

Диагностика инфекционных заболеваний

Инфекционные заболевания диагностируются по наблюдаемым симптомам и с помощью лабораторных тестов. Тесты могут быть основаны на поиске самого микроорганизма или его частей (бактериальных и вирусных антигенов), продуктов жизнедеятельности микроорганизмов (например, бактериальных токсинов) или на реакции организма на возбудителя болезни (присутствие антител или измененные концентрации каких-либо белков). В последнее десятилетие обычными стали тесты на наличие вирусной или бактериальной ДНК или РНК.

Лабораторные тесты включают в себя множество методов, некоторые из которых использовались на протяжении десятилетий, а некоторые, как тесты на ДНК и РНК с помощью ПЦР сравнительно новые. В зависимости от типа теста и предполагаемого диагноза, можно проверить наличие инфекции в слюне, крови, моче, кале и спинномозговой жидкости.

Первые тесты для обнаружения и определения микроорганизмов в клинических образцах были основаны на антисыворотке к определенным микробам. Антитела несли на себе флуоресцентную метку, и если они связывались с микробами, их можно было увидеть под микроскопом. Другие ранние тесты включали: 1) выращивание культуры микроорганизмов из образца на разных питательных средах, наблюдение за их внешним видом и определение – такой тест часто занимает недели; 2)определение специфических антител в крови с помощью разновидностей иммуноферментного анализа и 3) тесты по иммунопреципитации в агаре, когда антиген и антисыворотка диффундируют в агаре и формируют видимые полосы когда связываются друг с другом. Многие из этих тестов по-прежнему применяются.

Применяемые в настоящий момент диагностические тесты включают:

Тип теста	Описание	Примеры
Иммунофлуоресцентный анализ	Детекция определенных микроорганизмов с помощью флуоресцентных меток	E. coli O157:H7 Идентификация респираторных вирусов
Агглютинация	Образование видимого осадка при связывании антигена и антитела	Грам-положительные бактерии, такие как Staphylococcus aureus Грибы (Cryptococcus neoformans и Candida sp.)
Иммунохроматография	Тесты на бумажных полосках или карточках	E. coli O157:H7 Legionella Mycoplasma pneumoniae
Тесты на плашках	ИФА или РИА (радиоимммунологический анализ) для определения микроорганизмов, продуктов их жизнедеятельности, и антител. В РИА вместе ферментов используется радиоактивная метка.	E. coli O157:H7 Legionella Вирус гриппа Антиген ВИЧ Антитела к ВИЧ Giardia
Молекулярные методы	Обнаружение микробной РНК или ДНК с помощью ПЦР и других методов; используется также для выявления бактериальной устойчивости к антибиотикам	Mycobacterium tuberculosis ВИЧ Chlamydia trachomatis Цитомегаловирус (CMV) Тестирование на устойчивость к антибиотикам
Микроскопия	Визуальная идентификация, основанная на специфическом окрашивании или физических характеристиках.	Электронная микроскопия вируса Эболы Световая микроскопия паразитов (простейших, гельминтов и.т.п.)

Стимулирование иммунной системы с помощью вакцинации:

Доктора используют свойства иммунного ответа для того, чтобы придать нам устойчивость к определенным заболеваниям до того, как мы с ними столкнемся. Во время вакцинации наш организм сталкивается с безвредными формами патогена, которые вызывают первичный иммунный ответ. Также необходимы частые бустер-дозы вакцины, чтобы вызывать вторичный иммунный ответ и поддерживать в крови высокий уровень антител. Для иммунизации используются разные виды вакцин:

1. Живые аттенюированные вакцины состоят из ослабленных (аттенюированных) микробов, не способных вызвать болезнь. С помощью современных методов, можно ослабить микробы удалив или инактивировав некоторые гены; раньше ученые просто отбирали менее патогенные штаммы, возникающие естественным путем. Примеры живых вакцин: вакцина от полиомиелита (вакцина Сабина), от кори, свинки и оспы.

2. Убитые, или инактивированные вакцины сделаны из микробов, убитых при нагревании или химическом воздействии. Инактивированные вакцины гораздо безопаснее, чем живые, особенно для людей с ослабленным иммунитетом, но они обычно не вызывают такого сильного иммунного ответа, как живые вакцины. Примерами таких вакцин могут служить вакцины от бешенства, холеры, полиомиелита (вакцина Солка) и гриппа.

3. Субъединичные вакцины состоят из частей микробов. Они включают в себя один или несколько антигенов и могут быть произведены из организмов или получены с помощью молекулярно-биологических методов. Примерами могут служить вакцины от гепатита Б, сибирской язвы или столбняка.

4. ДНК-вакцины - это новое слово в разработке вакцин. ДНК, кодирующая микробные антигены, вводится пациенту. Она попадает в клетки, транскрибируется и транслируется, и синтезируемый белок вызывает иммунный ответ. Пока еще ни одна ДНК-вакцина не используется, но некоторые проходят клинические испытания.

5. Вакцины из антител – это еще одно новшевство. Способность производить человеческие моноклональные антитела с помощью технологии рекомбинантной ДНК означает, что можно приготовить антитела против какого-то микроорганизма и безопасно вводить их людям. Например, человеческие моноклональные антитела против одного из антигенов сибирской язвы скоро могут начать прохождение клинических испытаний.

6. Иммунотерапия – это вакцинация, используемая для лечения болезни уже после заражения. Некоторые варианты иммунотерапии применяются уже много лет, например введение сывороточных иммуноглобулинов при заражении гепатитом или введение лошадиного антивенина (сыворотки, содержащей антитела к различным ядам) при укусе змеи. Других примеров иммунотерапии не так много. Пожалуй, самым известным является вакцинация от бешенства, состоящая из 5 доз вакцины, вводимых в течение 30 дней. Если начать курс вакцинации сразу же после заражения, вакцина со 100% эффективностью предотвращает бешенство. Вакцинация от оспы также предотвращает развитие болезни, даже если вакцина введена в течение 2-3 дней после заражения. Если вакцина введена через 5 дней после заражения, она предотвращает возможный смертельный исход заболевания, хотя уже не предотвращает саму болезнь.

Получение антител

Используемые для исследований антитела могут быть получены в лаборатории, как in vivo, так и in vitro. Есть два типа получаемых антител: поликлональные и моноклональные (последние стали доступны только в течение последних 30 лет).

В настоящий момент технологии рекомбинантной ДНК коренным образом изменили методики получения антител, и хотя большинство антител еще производят традиционными методами используя животных или культуры клеток животных, методы с использованием рекомбинантной ДНК становятся все более и более распространенными.

Х ронология технологии получения антител

Поликлональные антитела

Поликлональные антитела получают, иммунизируя животных (обычно кроликов, овец или коз) и собирая их сыворотку. Например, можно ввести в козу очищенный белок ВИЧ gp120 и в ее организме будут синтезироваться антитела ко многим эпитопам этого белка. Затем из козы берется кровь, содержащая антитела, и из крови удаляются клетки. То, что получилось, называется антисывороткой к gp120. Она может непосредственно использоваться для экспериментов, или из нее выделяется фракция иммуноглобулинов. Полученные антитела называются поликлональными, потому что они представляют собой смесь антител, произведенных многими разными клонами B клеток. Поликлональные антитела просто и дешево получить, но во-первых, они представляют из себя смесь антител ко всем возможным эпитопам, во-вторых, результаты выделения антител, даже из одного и того же животного, никогда не будут одинаковыми.

Моноклональные антитела

Для многих областей применения, например, для диагностических тестов, поликлональные антитела плохо подходят из-за высокой степени изменчивости. Во многих случаях предпочтительно иметь один вид антител из клона одинаковых B клеток. Клоны клеток, производящих только одно определенное антитело, можно получить из селезенки иммунизированной мыши, но такие клетки в лаборатории живут лишь несколько недель, что ограничивает возможности для масштабного получения антител. Тем не менее, B клетки могут приобрести возможность жить и производить антитела неограниченно долго, если слить их с бессмертными (раковыми) клетками. Полученная в результате такого слияния клеточная линия называется «гибридомой». Моноклональные антитела, производимые гибридными клетками, можно выделять из среды, в которой растут клетки; такие антитела всегда будут полностью идентичны друг другу.

Генетически модифицированные антитела

Способность антител находить свои мишени и связываться с ними сделало их идеальными кандидатами для разных видов терапии. Например, можно пришить к антителу, узнающему опухолевый антиген, хемотерапевтическое лекарство или радиоактивную метку, и ввести пациенту; он будет таким образом избавлен от многих побочных эффектов традиционной химио- и радиотерапии. Однако, антитела, получаемые из клеток животных, узнаются нашей иммунной системой как чужеродные объекты, и уничтожаются. С помощью технологии рекомбинантной ДНК можно получить антитела, которые человеческая иммунная система считает «своими» и которые можно использовать для лечения людей. (например, герцептин – это препарат на основе модифицированных антител, чрезвычайно эффективный при лечении определенных форм рака груди).

Использование технологий генной инженерии для получения антител также избавляет нас от необходимости убивать лабораторных животных. Ниже описаны два способа получения генно-модифицированных антител к определенному антигену.

Иммортализация гибридомы

С помощью технологии рекомбинантной ДНК можно переместить антиген-узнающий участок из известного мышиного моноклонального антитела на человеческое антитело, соединив часть мышиного гена с человеческим. Затем достаточно трансформировать этой ДНК бактерии и можно получать антитела в неограниченном количестве, причем культивировать бактерии гораздо легче и дешевле, чем клетки мышей.

Фаговый дисплей

Это современный метод получения новых антител к интересующим нам антигенам. Для этого антиген-узнающие участки миллиарды генов, кодирующих антитела из миллиардов B клеток помещаются в геномы фага лямбда (бактериофаги, или фаги, это вирусы бактерий; фаг лямбда это один из таких вирусов). Генно-модифицированные фаги экспонируют на своей поверхности антиген-узнающие участки человеческих антител. Полученная фаговая библиотека подвергается скринингу для того ,чтобы найти фагов, связывающихся с данным антигеном. Этих фагов для некоторых экспериментов можно использовать непосредственно вместо антител или же можно соединить участок ДНК из фага с геном, кодирующим человеческое антитело, трансформировать полученной рекомбинантной ДНК бактерии и получить большие количества антител, пригодных для применения в медицине. Фаговый дисплей – это на сегодняшний день последнее слово в иммунотерапии.

Мечение и обнаружение антител

Антитела используются в диагностике и научных исследованиях как средства для специфического мечения. Чтобы сделать метку видимой, антитела ковалентно пришивают (конъюгируют) к молекулам, которые можно легко обнаружить. Например, флуоресцентно меченное антитело позволяет вам локализовать антиген в клетке с использованием флуоресцентного микроскопа. Антитела также пришивают к ферментам, которые реагируют с различными субстратами с образованием окрашенных соединений, таким образом, окраска развивается только там, где присутствует антитело, и ее степень зависит от количества молекул конъюгированного с ферментом антитела. Связанные с ферментами антитела обычно используется в микроскопии, для вестерн-блотов (см. ниже) и в ИФА.

М ишени антител, или антигены, можно обнаружить непосредственно, пометив специфичные к данному антигену антитела.

Прямое обнаружение антител

Тем не менее, метить каждый вид антител, который может быть использован, дорого и сложно, поэтому более обычный метод визуализации антигена – это непрямое наблюдение, основанное на использовании поликлональных вторичных антител. Вторичные антитела узнают первичные антитела, полученные из определенного животного, при этом неважно, какая у первичных антител антигенная специфичность. Таким образом, первичные антитела специфично узнают и связывают антиген, а вторичные антитела узнают и связывают первичные антитела. При этом для обнаружения всех возможных видов первичных антител, полученных в одном животном, например, в кролике, достаточно одного вида меченых вторичных антител. У этого метода есть еще одно преимущество: вторичные антитела узнают множество отдельных эпитопов на поверхности первичных антител, и с одной молекулой первичного антитела может связаться сразу несколько молекул меченого вторичного антитела, усиливая сигнал.

Н епрямое обнаружение антител

Для получения вторичных антител, антитела из одного вида животных вводят другим животным. Например, если первичное антитело – это мышиное моноклональное антитело, для получения вторичных антител достаточно иммунизировать козу любым мышиным антителом. Затем козьи поликлональные анти-мышиные антитела выделяются из козьей сыворотки и сшиваются с ферментом. Вторичные антитела широко коммерчески доступны, как немеченые, так и с самыми разными химическими и ферментативными метками.

Использование антител

Антитела использовались на протяжении десятилетий как средство исследования, но в последние годы развитие технологий производства антител сделало возможным их применение во множестве новых областей. Основа всех иммунологических технологий - необычайная специфичность связывания антител и антигенов. Вот несколько примеров:

Иммуноокрашивание это способ локализации антигенов в органеллах, клетках, тканях, отдельных организмах и также способ отличить одну клетку от другой. Например, раковые клетки часто выглядит неотличимо от обычных под микроскопам, но при использовании иммуноокрашивания выявляются существующие различия в количестве и в видах находящихся на поверхности клеток белков (антигенов). Изучение этой информации помогает диагностировать рак и понять свойства раковых клеток.

С помощью иммуноокрашивание тканей или организмов можно узнать в каком типе клеток обычно находится интересующий нас белок, что в свою очередь помогает нам понять функцию этого белка. Например, иммуноокрашивание семян на разных стадиях созревания позволяет нам следить за количеством и расположением молекул белка по мере роста растения. Антитела для иммуноокрашивания конъюгированы с флуоресцентными молекулами, или с ферментами, которые катализируют образование окрашенных веществ.

Специальным приложением иммуноокрашивания является сортировка клеток. При этом процессе популяция клеток окрашивается флуоресцентно меченым антителом и физически разделяется на меченые и немеченые клетки. Клеточный сортер использует лазер для того ,чтобы «считать» флуоресцентную метку и электростатический заряд, чтобы разделить клетки в растворе. Он способен разделять до 30 000 клеток в секунду!

Иммуноблоттинг, или вестерн-блоттинг говорит о присутствии белка, его размерах и относительном количестве в данном образце (образец может представлять из себя сложную смесь белков, обычно это лизат клеток). Для осуществления блоттинга, белки, разделенные по размеру в полиакриламидном геле, под действием тока переносятся на нейлоновую или нитроцеллюлозную мембрану. Далее мембрана инкубируется с первичным антителом к интересующему исследователя белку, затем с конъюгированными с ферментом вторичными антителами. Окисляя хромогенный субстрат, фермент образует на мембране окрашенную полосу, или же, фермент может вызывать образование света (хемилюминисцентный субстрат), который вызывает образование засвеченной полосы на фотопленке. Размер белка определяется, сравнивая положение визуализированной полосы с маркерными белками известной массы, прогнанными на том же геле. Количество белка определяется по сравнению интенсивности полосы с интенсивностью маркерных полос.

Одной из модификацией вестерн-блоттинга является дот-блоттинг. При этом образец белка сразу капается на мембрану. Дот-блоттинг используется для быстрого скрининга большого числа образцов. На мембрану может быть одновременно нанесено много образцов, поэтому этот метод позволяет быстро определить, где присутствует определенный белок, но он не предоставляет никакой информации о размере изучаемого белка.

С уществует большое количество тест-полосок, или иммунохроматографических тестов. Есть тесты на беременность, на разные наркотики, инфекционные агенты (например на ВИЧ, чуму, E. coli O157:H7 и Legionella), даже на никотин и алкоголь. Эти тесты дают положительный или отрицательный ответ в течение минут. Они основаны на использовании многих антител, одно из которых обычно мечено окрашенным соединением, например коллоидным золотом. Накопление таких антител в определенной зоне вызывает появление там розовой полосы. Например, домашние тесты на беременность детектируют человеческий хорионный гонадотропин (ХГЧ) – гормон, который появляется в крови и моче беременной женщины через несколько дней после оплодотворения. Ближе к нижнему краю на тестовую полоску нанесены мышиные моноклональные антитела к ХГЧ, связанные с розовым коллоидным золотом(шаг 1). После того, как нижний край полоски погружается в мочу, жидкость начинает подниматься наверх под действием капиллярной силы, вместе с ней перемещаются и антитела. Если в моче содержится ХГЧ, он связывается с антителами (шаг 2). Когда комллексы достигают первой тестовой зоны, они связываются с антителами к ХГЧ, фиксированными на полоске, и концентрируются в виде розовой полосы (шаг 3). На полоске всегда есть внутренний контроль в виде фиксированных козьих поликлональных антимышиных антител (узнающих антитела к ХГЧ как связанные, так и не связанные с антигеном) (шаг 4). Таким образом, любой работающий тест дает одну розовую полосу, но только при положительном результате теста можно увидеть две полосы.

Приложение Б: Словарь терминов

3,3’,5,5’-тетраметилбензидин (ТМБ): растворимый колориметрический субстрат, окисляемый пероксидазой хрена в вещество, имеющее синюю окраску. Часто используется в ИФА.

Антиген: любое вещество, которое связывается антителами или Т-клетками и способно вызвать специфический иммунный ответ.

Антитело: белок (иммуноглобулин), синтезирующийся клетками иммунной системы в ответ на столкновение с чужеродным агентом.

Антисыворотка: сыворотка крови, содержащая антитела против определенного антигена

Аутоиммунная болезнь: Болезнь, которая возникает в результате того, что иммунная система атакует клетки своего организма, считая их чужими. Примерами являются системная красная волчанка (эритематоз), ревматоидный артрит и множественный склероз.

Бактериофаг (фаг): вирус, который инфицирует бактерий. Может быть использован для того, чтобы внедрить чужеродную ДНК в бактериальный геном.

Вакцинация: процесс стимулирования образования вторичного иммунитета путем введения непатогенной формы агента, вызывающего болезнь. Слово «вакцинация» происходит от латинского слова vacca – корова- потому что первая проведенная вакцинация это была вакцинация коровьей оспой от оспы человеческой.

Врожденный иммунитет: иммунитет, с которым человек рождается. Включает в себя такие клетки, как циркулирующие макрофаги, которые первыми вступают в контакт с чужеродными агентами. Также называется неадаптивным иммунитетом.

Зооноз: инфекция, передаваемая людям от животных, например бешенство, или атипичная пневмония.

Клон, клонирование: в контексте молекулярной биологии, клонирование – это получение фрагмента ДНК из генома и сшивание его с другой молекулой ДНК, так что теперь эта другая молекула ДНК включает в себя полную копию клонированного фрагмента. В контексте клеточной биологии, «клон» - это группа клеток, произошедшая из одной родительской клетки и несущая идентичную генетическую информацию.

Коньюгат: вещество, образовавшееся в результате ковалентной сшивки двух разных молекул, например, фермента пероксидазы пришитой к антителу.

Генетически модифицированный организм (ГМО): организм, генетический материал которого был направленно изменен с помощью технологии рекомбинантной ДНК.

Иммунная недостаточность: ослабление иммунного ответа, так что иммунная система становится неспособной эффективно защищать организм от болезней. Может быть вызвана генетическими нарушениями, приемом иммуносупрессантов и другими факторами.

Иммуноген: любой агент, вызывающий иммунный ответ. Иммуногены. которые специфично узнаются Б и Т клетками и вызывают специфичный иммунный ответ (приобретенный иммунитет) называются антигенами.

Иммуноглобулин (Ig): общий термин для обозначения антител

Иммунология: изучение иммунной системы, системы органов, защищающей организм от чужеродных веществ, клеток и организмов.

Лигировать: соединить два фрагмента ДНК вместе, например, поместить фрагмент гена, кодирующего антитело, в геном фага.

Лимфоцит: вид белой кровяной клетки. Компонент иммунной системы. Б-лимфоциты созревают в костном мозге, а Т-лимфоциты в тимусе.

Макрофаг: вид белых кровяных клеток. Макрофаги могут окружать и поглощать чужеродные вещества и антигены, этот процесс называется фагоцитозом. У макрофагов есть две основных функции: 1) удаление чужеродных клеток и молекул из крови; 2) переработка (процессинг) антигенов и экспонировании их на своей поверхности.

Микроплашка: пластиковая 96-луночная плашка, предназначенная для ИФА

Оппортунистические инфекции: инфекции, возникающие при ослабленном иммунитете, например кандидоз и туберкулез, развивающиеся у больных СПИДом.

Пассивный иммунитет: приобретение антител из внешнего источника, например, передача с молоком матери или введение антител для лечения болезни (например, при заражении бешенством). Пассивный иммунитет длится только в течение нескольких недель.

Патоген: организм, или вещество, вызывающее болезнь. Патогенами могут быть бактерии, вирусы, грибы, паразитические одноклеточные, черви, и даже инфекционные белки (прионы).

Первичное антитело: в иммунологическом тесте, антитело ,связывающее антиген и дающее специфичность тесту.

Вторичное антитело: в иммунологическом тесте, антитело ,связывающее первичное антитело. Часто вторичные антитела помечены определенным образом для того, чтобы можно было их обнаружить.

Пероксидаза хрена: фермент, часто использующийся для определения вторичных антител. Катализирует окисление разных субстратов перекисью водорода (H₂O₂). Если в результате реакции образуется окрашенный продукт, он может быть определен колориметрически.

Приобретенный иммунитет: специфический ответ на определенное чужеродное вещество, возникающий в результате нескольких контактов с ним.

Сероконверсия: появление детектируемого уровня антител против определенного агента в крови. Например, антитела к ВИЧ в крови можно обнаружить лишь через 6 недель после заражения.

Субстрат: молекула, на которую действует данный фермент

Сыворотка: прозрачная жидкость, получающаяся при удалении из крови крупных частиц, т.е. красных и белых кровяных клеток.

ТМБ: см. 3,3’,5,5’-тетраметилбензидин

Фаговый дисплей: метод создания новых антител против определенных антигенов с помощью технологии рекомбинантной ДНК и бактериофагов.

Фермент: белок с каталитической активностью. Молекула, на которую действует фермент, называется субстратом. Ферменты классифицируют и называют по видам реакций, которые они катализируют.

Хромогенный: «дающий цвет». Хромогенными называют субстраты ферментативных реакций, которые в результате реакции дают окрашенные продукты. Например, 3,3’,5,5’-тетраметилбензидин (ТМБ) при окислении пероксидазой хрена дает синий продукт.

Эпитоп: отдельный участок на поверхности антигена, с которым связывается антитело. Также называется «антигенной детерминантой».

Приложение В: Описания болезней

ВИЧ/СПИД

Подходящие протоколы: все

Название патогена	Вирус иммунодефицита человека, ВИЧ
Тип организма	Ретровирус
Инфекционный агент	Вирус
Метод распространения	Половые контакты Использование общих игл при употреблении наркотиков Использование нестерильных медицинских инструментов От матери детям во время беременности При переливании крови или пересадке донорских органов Не распространяется при обычных контактах
Инкубационный период	От 2 месяцев до более 10 лет
Симптомы	В первые 1-2 месяца после заражения – симптомы гриппа Во время асимптоматического периода (от 2 месяцев до >10 лет) иммунная система медленно разрушается, и симптомы могут включать в себя потерю веса, слабость, частые лихорадки, частые грибковые заболевания, сыпь на коже, ухудшение кратковременной памяти Во время развития СПИДа, из-за заражения оппортунистическими инфекциями может наблюдаться кашель, затруднение дыхания, судороги, потеря координации, нарушение сознания, частый понос, лихорадка, потеря зрения, тошнота, сильные головные боли, сильная слабость и кома.
Инфекционность	От времени заражения
Диагностика	В первые 4-8 недель после заражения вирус можно обнаружить с помощью ИФА к белку p24 или с помощью вестерн-блота После 4-8 недель с помощью ИФА можно обнаружить в крови антитела к ВИЧ
Лечение	Ингибиторы обратной транскриптазы, например АЗТ Ингибиторы протеазы Комплексное антиретровирусное лечение Лечение оппортунистических инфекций
Смертность	Широко варьирует в зависимости от географического положения больных
История	Первый известный случай в 1959 году. ВИЧ мог распространиться от животных к человеку. Болезнь была описана и названа синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) в 1982 году, вирус иммунодефицита человека был выделен в 1983.

Предполагаемые сценарии для класса:

Ролевая игра, в которой ученики выполняют роль ученых в клинической лаборатории местной больницы и делают тесты на ВИЧ. Существуют тесты ИФА на антиген к ВИЧ (капсидный белок p24) и на сывороточные антитела к ВИЧ.

Оспа

Подходящие протоколы: все

Название патогена	Вирус оспы, Variola major
Тип организма	ДНК-вирус из рода Orthopoxvirus
Инфекционный агент	Вирус (для заражения достаточно нескольких вирусных частиц)
Метод распространения	От человека к человеку воздушно-капельным путем Через инфицированную одежду, постель или вещи Вирус может оставаться живым до 24 часов при оптимальных условиях
Инкубационный период	12-14 дней
Симптомы	Высокая температура, недомогание, боли головы и тела, сыпь на коже, переходящая в гнойные пузырьки (оспины)
Инфекционность	Период максимальной инфекционности - начало появления сыпи, инфекционность сохраняется до полного исчезновения сыпи.
Диагностика	По симптомам. Идентификация вируса с помощью электронной микроскопии. Идентификация вирусной ДНК молекулярно-биологическими методами. Разработка ИФА к IgG, IgM и антителам - важная задача для многих компаний (оспа была уничтожена до того, как появились современные иммунологические методы диагностики)
Лечение	Вакцинация в течение 2-3 дней после заражения предотвращает развитие заболевания Вакцинация в течение 4-5 дней после заражения может предупредить смертельный исход болезни После 4-5 дней, только поддерживающее лечение. Экспериментальное антивирусное лечение
Смертность	До 30%
История	Использовался в качестве биологического оружия Великобританией в Северной Америке в 18 веке. Армия раздавала индейцам одеяла, снятые с оспенных больных. Смертность в некоторых племенах индейцев достигала 50%. В 1796 году Дженнер создал на основе коровьей оспы вакцину, защищающую людей от оспы. Усилия по всеобщей вакцинации позволили искоренить оспу в 1977 году, и вакцинации были прекращены.

Предполагаемые сценарии для класса:

Протоколы I и II:

Ролевая игра: ваши ученики подверглись биологической атаке с использованием распыленного вируса оспы, возможно, кто-то заразился, в этом случае, ему необходима немедленная вакцинация. Вакцинировать всех подряд не очень хорошо, потому что вакцинация может иметь неприятные побочные эффекты Важно как можно быстрее узнать, кто заражен.

Протокол III:

Ролевая игра: ваши ученики исследуют, насколько долго сохраняются в крови антитела к оспе, полученные после вакцинации. Прививки были обязательны до 1978 года; надо определить, сохраняют ли современные 30-летние люди иммунитет к оспе.

Трихинеллез

Подходящие протоколы: протокол III

Название патогена	Trichinella spiralis и еще 4 родственных вида
Тип организма	Нематода
Инфекционный агент	Личинка
Метод распространения	Поедание цист личинок, содержащихся непрожаренном мясе (обычно свинине)
Инкубационный период	Личинки попадают в тонкий кишечник, где меньше чем за 8 дней достигают зрелости и размножаются. В течение следующих 1-4 месяцев они продуцируют до 1500 новых личинок. Эти личинки мигрируют в поперечно-полосатую мускулатуру, где формируют цисты (покоящиеся стадии). Цисты сохраняют жизнеспособность в течение многих лет.
Симптомы	Ранние симптомы (во время созревания личинок) могут включать тошноту, судороги и понос. В легких случаях симптомов может быть мало. Поздние симптомы включают температуру и боли в суставах и мышцах В особо тяжелых случаях инфекция может вызывать проблемы с координацией, сердцем и дыханием. Смерть возникает от воспаления сердечной ткани. Симптомы прекращаются только когда все личинки полностью сформируют цисты.
Инфекционность	Цисты могут содержаться в кале; тем не менее, заражение происходит только при поедании зараженного мяса.
Диагностика	Биопсия мышц (часто языка) ИФА для обнаружения антител против Trichinella
Лечение	Лечение нужно начать как можно раньше. Лечат только симптомы; аспирин и другие болеутоляющие используются для облегчения болей в мышцах, в случае особо сильных болей применяются стероидные препараты. Нет средства от образовавших цисты личинок Экспериментальное лечение мебендазолом, противогельминтным препаратом. Мебендазол не дает червю всасывать сахар и червь постепенно погибает от голода.
Смертность	Приблизительно 1%
История	Встречается повсеместно, но наиболее часто в Европе и Соединенных Штатах В течение 2,5 летнего периода в 1990 годах было зарегистрировано более 10 000 случаев во всем мире. Заражение происходило от мяса свиней, диких кабанов, лошадей и дичи.
Предотвращение	Личинки погибают при тщательной термической обработке мяса или при замораживании мяса Копчение мяса не всегда убивает личинок

Предполагаемые сценарии для класса:

Через месяц после поездки на шашлыки, некоторые из ваших учеников жалуются на тошноту и судороги. Вы подозреваете трихинеллез. ИФА на антитела против Trichinella подтверждает диагноз у некоторых учеников. (Антитела появляются в крови через 3-5 недель после заражения).

Атипичная пневмония

Подходящие протоколы: все

Название патогена	Коронавирус
Тип организма	Вирус
Инфекционный агент	Вирус
Метод распространения	Близкий контакт между людьми: кашель или чихание, заражение также может происходить когда люди дотрагиваются до зараженных поверхностей, а потом касаются руками глаз, рта или носа. Нет свидетельств того, что вирус распространяется по воздуху
Инкубационный период	Симптомы появляются в течение 10 дней после заражения
Симптомы	Температура выше 38ºС и другие симптомы, аналогичные гриппу. Респираторные симптомы (кашель и затруднение дыхания) могут наблюдаться после 2-7 дней инфекции
Инфекционность	Пациенты наиболее заразны примерно на 10 дне инфекции, когда у них выражены респираторные синдромы (кашель и чихание)
Диагностика	Первоначальный диагноз по симптомам и эпидемиологии: т.е. входил ли пациент в контакт с другим больным или был ли он в течение 10 дней в области, где наблюдается атипичная пневмония. Лабораторные тесты включают в себя: 1)ИФА для обнаружения вируса 2)ПЦР 3)Обнаружение РНК вируса с помощью обратной транскрипции 4) ИФА на антитела к вирусу (антитела могут быть обнаружены в крови в течение 21 дня после начала заболевания)
Лечение	Специальных лекарств нет. Симптомы лечатся стандартными лекарствами от симптомов пневмонии. Идут тесты антивирусных препаратов.
Смертность	По данным на май 2003, 8%
История	Впервые был выявлен в феврале 2003 года. Судя по всему, впервые появился в сельской местности Китая, возможно осенью 2002. Вирус распространяется по миру вместе с авиаперевозками

Предполагаемые сценарии для класса:

Некоторые из ваших учеников были в поездке в другой стране. Оказалось, что в отеле, в котором они жили, было зарегистрировано несколько случаев атипичной пневмонии. Надо сделать тесты, чтобы узнать, не заразился ли кто-то из них, и в последнем случае как можно быстрее изолировать больных.

Приложение Г: Дополнения к урокам

Справки по разным болезням

В Интернете, например, на сайте ВОЗ, можно найти много информации по разным инфекционным болезням. Также вы можете найти сайты фармацевтических компаний, предлагающих новейшие средства диагностики болезней. Вы можете попросить ваших учеников самостоятельно заполнить следующую таблицу для какой-то болезни, либо по выбору учеников, либо по вашему выбору.

Это задание поможет вашим ученикам научиться отличать «плохую» и «хорошую» информацию в Интернете. Есть множество сайтов, рекламирующих недоказанные средства лечения и содержащих неправильную медицинскую информацию, так как не существует служб, контролирующих распространение фальшивой информации в сети.

Название болезни:____________________

Название патогена
Тип организма
Инфекционный агент
Метод распространения
Инкубационный период
Симптомы
Инфекционность
Диагностика
Лечение
Смертность
История

Использованная литература:_________________________

Полуколичественный ИФА

ИФА не только быстро дает качественный (да/нет) ответ: основная его сила в возможности получать количественные (сколько?) результаты. Это дополнение описывает, как можно адаптировать этот набор, чтобы сделать количественный тест для определения концентрации антигена или антитела (в данном случае полуколичественный, потому что у вас скорее всего не будет требуемого специального оборудования). Приведенный ниже протокол написан для определения концентрации антигена (на базе протокола II), но он может быть адаптирован и к протоколу III.

Вы должны будете приготовить серийные разведения антигена в известной концентрации. По мере того, как концентрация антигена или антитела увеличивается, увеличивается интенсивность синей окраски. Интенсивность окраски можно зрительно сравнить с контрольными образцами известной концентрации и таким образом примерно оценить концентрацию антигена или антитела в образце. Для того ,чтобы провести точные измерения, нужен специальный спектрофотометр для плашек. Спектрофотометр измеряет поглощение света определенной длины волны (например, окисленный субстрат ТМБ поглощает свет длиной 655 нм). Измерив поглощение опытного образца и контролей, можно достаточно точно установить концентрацию вещества в образце.

Подготовка преподавателя к работе

Мы настоятельно рекомендуем, чтобы вы хорошо освоились сначала с базовыми протоколами этого набора. Очень важно иметь в виду информацию про стабильность реагентов на стр. 19.

Подготовка к работе аналогична подготовке для протокола II, но на каждом рабочем месте будут две дополнительные пробирки: одна с образцом известной концентрации, другая с PBS. На одно рабочее место, рассчитанное на четырех человек, будут приходиться всего два опытных образца. Они будут содержать разный уровень антигена. Вы можете пометить их «А» и «Б» или инициалами воображаемых пациентов. Вам также понадобятся две чистые 15 мл пробирки или аналогичные емкости.

Полуколичественный ИФА: пошаговое руководство для подготовки

Рассчитано на подготовку 12 рабочих мест, каждое для 4 учеников

Реагенты в составе набора	Необходимое количество
Антиген, куриный гамма-глобулин, сухой	1 флакон
Первичные антитела, кроличьи анти-куриные поликлональные антитела, сухие	1 флакон
Вторичные антитела, козлиные анти-кроличьи антитела, конъюгированные с пероксидазой, сухие	1 флакон
Субстрат пероксидазы (ТМБ)	1 банка
10х фосфатно-солевой буфер (PBS)	1 банка
10% Твин 20	1 банка
Дополнительные реагенты
Дистиллированная вода (рекомендуется стерильная вода)	1 л

Шаг 1. Приготовьте буферные растворы

Мы рекомендуем вам использовать градуированные цилиндры на 100 мл и на 1 л для приготовления растворов. Вам также понадобится 1 л дистиллированной воды.

Буфер	Объем	Реагент	Используется для
1х PBS, 100 мл	90 мл	Дистиллированная вода	Приготовления стоковых (50x) растворов антигена, первичных и вторичных антител Разведение антигена для приготовления положительного контроля и образца известной концентрации. Приготовление образцов для учеников Отрицательный контроль Приготовление серии разведений известной концентрации.
	10 мл	10х PBS
Промывочный буфер, 900 мл	805 мл	Дистиллированная вода	Разведение 50x растворов антител Промывка плашек
	90 мл	10х PBS
	4.5 мл	10% Твин 20

Шаг 2. Приготовьте стоковые растворы антигена и антител

Осторожно откройте флаконы с лиофилизованными антигеном и антителами и чистой пипеткой добавьте 0.5 мл 1x PBS в каждый из них. Закройте флаконы и хорошо перемешайте. Получившиеся растворы это 50-кратные концентраты, или «стоковые» растворы. Внимание: на этом этапе не используйте промывочный буфер.

Шаг 3. Разведите 50-кратные растворы

Подготовьте по 50 мл бутылке или пробирке для растворов антигена, первичных и вторичных антител. Подготовьте по 15 мл пробирке для образцов учеников «А» и «Б». Используйте чистую пипетку, чтобы добавить нужное количество концентрированного стокового раствора в соответствующую бутылку или пробирку.

Раствор	Объем	Реагент	Используется для
1х антиген	24.5 мл	1х PBS	Положительный контроль Концентрат для приготовления образцов «А» и «Б» Образец известной концентрации
	0.5 мл	50x антиген
	Внимание: не добавляйте раствор, содержащий Твин 20 в раствор антигена, иначе эксперимент не будет работать
1х раствор первичных антител	24.5 мл	Промывочный буфер	Первичные антитела
	0.5 мл	50х кратный раствор первичных антител
	С помощью пипетки промойте флакон с 50х раствором антител приготовленным однократным раствором, чтобы смыть остатки стокового раствора со стенок Закройте бутыль или пробирку с приготовленным раствором крышкой и хорошо перемешайте
1х раствор вторичных антител	24.5 мл	Промывочный буфер	Вторичные антитела
	0.5 мл	50х раствор вторичных антител
	Разводите вторичные антитела не ранее чем за сутки до начала работы С помощью пипетки промойте флакон с 50х раствором антител приготовленным однократным раствором, чтобы смыть остатки стокового раствора со стенок Закройте бутыль или пробирку с приготовленным раствором крышкой и хорошо перемешайте
Антиген, 125 нг/мл (раствор «А») в 15 мл пробирке	8.75 мл	1х PBS	Образец А
	1.25 мл	1х антиген
Антиген, 25 нг/мл (раствор «Б») в 15 мл пробирке	9.75 мл	1х PBS	Образец Б
	0.25 мл	1х антиген
	Закройте 15 мл пробирки и хорошо перемешайте

Шаг 4. Приготовьте аликвоты растворов для обеспечения всех рабочих мест

Пробирки	Описание	Подписать	Содержимое
Фиолетовые пробирки, 12 шт	Положительный контроль	«+»	0.5 мл раствора антигена (положительный контроль)
Синие пробирки, 12 шт	Отрицательный контроль	«-»	0.5 мл 1х PBS
Зеленые пробирки, 12 шт	Первичные антитела	«П.А.»	1.5 мл 1х раствора первичных антител
Оранжевые пробирки, 12 шт	Вторичные антитела	«В.А.»	1.5 мл 1х раствора вторичных антител
Коричневые пробирки, 12 шт	Субстрат пероксидазы (ТМБ)	«Субстрат»	1.5. мл раствора ТМБ
	Внимание: ТМБ чувствителен к свету, поэтому важно хранить его именно в темных пробирках.
Желтые пробирки, 12 шт	Образец известной концентрации	«Антиген, 1000 нг/мл»	0.25 мл 1х раствора антигена
Желтые пробирки, 12 шт	1х PBS	«PBS»	1 мл 1х PBS
Желтые пробирки, 12 шт	Антиген, 125 нг/мл	«А»	0.25 мл раствора «А»
Желтые пробирки, 12 шт	Антиген, 25 нг/мл	«Б»	0.25 мл раствора «Б»

Шаг 5. Подготовьте рабочие места учеников

Список для проверки рабочих мест. Одно рабочее место рассчитано на 4 учеников

Предмет	Содержимое	Количество	()
Желтые пробирки (А и Б)	Образцы для анализа (0.25 мл)	2 шт	
Желтые пробирки (Антиген, 1000 нг/мл)	1х антиген (0.25 мл)	1 шт	
Желтые пробирки (PBS)	1x PBS (1 мл)	2 шт	
Фиолетовая пробирка (+)	Положительный контроль (0.5 мл)	1 шт	
Синяя пробирка (-)	Отрицательный контроль (0.5 мл)	1 шт	
Зеленая пробирка (П.А.)	Первичные антитела (1.5 мл)	1 шт	
Оранжевая пробирка (В.А.)	Вторичные антитела (1.5 .мл)	1 шт	
Коричневая пробирка (Субстрат)	Субстрат пероксидазы (ТМБ) 1.5 мл	1 шт	
12-луночные стрипы		2 шт	
Микропипетка		1 шт	
Желтые носики для микропипетки		10-20 шт	
Одноразовые пластиковые пипетки		1шт	
70-80 мл промывочного буфера в стакане	Фосфатно-солевой буфер (PBS), содержащий 0.05% Твин 20	1 шт	
Большая пачка бумажных полотенец		2	
Черный фломастер (маркер)		1 шт	

Протокол работы для учеников

1. Подпишите каждую лунку одного из 12-луночных стрипов цифрами от 1 до 12. Подпишите первые три лунки второго стрипа «+» (положительный контроль), следующие три лунки «-» (отрицательный контроль), следующие три лунки предназначены для одного образца (образца А), другие для другого (см. рис)

2. С помощью микропипетки добавьте 50 мкл PBS из желтой пробирки с надписью «PBS» в лунки, помеченные цифрами от «2» до «12».

3. Добавьте 100 мкл из желтой пробирки, подписанной «Антиген, 1000 нг/мл» в лунку помеченную цифрой «1»

4. Приготовьте серийные разведения в лунках со 1й по 12ю следующим образом:

А.Возьмите 50 мкл раствора из лунки 1 и перенесите в лунку 2. Перемешайте раствор в лунке, пипетируя.

Б.Используя ту же самую пипетку, возьмите 50 мкл раствора из лунки 2 и добавьте в лунку 3. Перемешайте

В.Используя ту же самую пипетку, возьмите 50 мкл раствора из лунки 3 добавьте в лунку 4. Перемешайте

Г.Таким образом, приготовьте разведения в лунках 5-11. Когда дойдете до 11 лунки, отберите оттуда 50 мкл и сбросьте в слив.

5. На втором стрипе, добавьте чистым носиком 50 мкл положительного контроля в первые три лунки, чистым носиком 50 мкл отрицательного контроля в следующие три лунки, затем добавьте по 50 мкл опытных образцов в подписанные соответствующим образом лунки.

6. Далее протокол совпадает с протоколом II

Анализ результатов

Концентрация 1х антигена – 1000 нг/мл. (1 мкг/мл). Внимание: если вы хотите количественно определять концентрации антител, концентрация однократной сыворотки тоже 1 мкг/мл. Отсюда при разведении получаются следующие концентрации в лунках:

С равните интенсивность синей окраски в лунках, содержащих опытные образцы, с окраской лунок, содержащих антиген в известной концентрации. Определите, какие лунки наиболее соответствуют опытным образцам по цвету, и исходя из этого, примерно определите концентрации. Сравните полученные результаты с реальными значениями (125 и 25 нг/мл)

Возможные сценарии для полуколичественного ИФА

Измерение концентрации вируса в крови чрезвычайно важно при лечении ВИЧ-инфицированных. Антиретровирусная терапия направлена на то, чтобы уровень вируса держался около границы чувствительности. Некоторые из применяемых в настоящее время лекарств это эфавиренц, индинавир,нелфинавир, ритонавир, зидовудин, диданозин и ставудин. При лечении обычно необходимо принимать комбинации разных лекарств строго регулярным образом (об этом можно подробнее прочитать в Интернете). Обратной стороной приема противовирусных препаратов являются тяжелые побочные эффекты.

Ваши ученики работают в фармацевтической компании и должны проверить эффективность новых комбинаций лекарств со сниженной токсичностью. Если комбинация подобрана удачно, уровень ВИЧ в крови пациентов должен быть очень низким, на границе чувствительности. Если комбинация неудачная, концентрация вируса будет высокой. Ваши ученики должны сравнить две комбинации лекарств и определить какая из них работает лучше.

Другой сценарий (для протокола III) предполагает измерение уровня антител в крови. Предполагается, что пациент мог заразиться сибирской язвой. У ваших учеников есть два образца крови от одного и того же пациента, взятые сразу после развития симптомов и три недели спустя. Если это действительно сибирская язва, уровень антител к бактериям, вызывающим ее, должен подняться через 3 недели. (Образец «Б» это образец взятый сразу после появления симптомов и образец «А» это образец взятый три недели спустя)

Приложение Д: Библиография

Benjamini E aet al., Immunology: A short Course, Wiley-Liss, New York (1996)

Berman HM aet al., The Protein Data Bank, Nucleic Acids Res 28, 235-242 (2000)

Breitling F and Dubel S, Recombinant Antibodies, John Wiley & Sons, New York (1999)

Harris LJ et al., Crystallographic structure of an intact IgG monoclonal antibody, J Mol Biol 275, 861-872 (1998)

Harlow E and Lane D (eds), Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1999)

Kaufmann SHE et al. (eds), Immunology of Infectious Diseases, ASM Press, Washington, DC (2002)

Lashley FR and Durham JD (eds), Emerging Infectious Diseases, Springer Publishing Company, New York (2002)

Law B (ed), Immunoassay: A Practical Guide, Taylor & Francis, Bristol (1996)

Momany C et al., Crystal structure of dimeric HIV-1 capsid protein, Nat Struct Biol 3, 763-770 (1996)

Truant AL 9ed), Manual of Commercial Methods in Clinical Microbiology, ASM Press, Washington, DC (2002)

Полезные Интернет-ресурсы:

The Merck Manual of Diagnosis and Therapy

http://www.merck.com/pubs/mmanual

The Merck Veterinary Manual

http://www.merckvetmanual.com/mvm/index.jsp

http://www.who.int/ru сайт ВОЗ

http://www.cdc.gov Центр по контролю и предотвращению заболеваний США

http://www.niaid.nih.gov Национальный институт аллергий и инфекционных болезней США

http://www.usamriid.army.mil

http://www.fda.gov/cdrh/clia/index.html

http://www.bioterry.com/ History_of_Biological_Terrorism.asp

127