Набор для иммуноферментного анализа (ифа) Учебное руководство

Иммунология это наука, изучающая иммунную систему, то есть то как наш организм защищает себя от чужеродных и потенциально болезнетворных микроорганизмов и молекул. У иммунной системы есть три основных функции:

1. Распознавать чужеродные молекулы (захватчиков)

2. Адекватно реагировать на них, чтобы защитить организм

3. Отреагировать в следующий раз при встрече с теми же патогенами

Иммунная система млекопитающих производит молекулы, называемые антителами, которые способны распознавать чужеродные молекулы с невероятной точностью. Антитела находят свои цели и связываются с ними, как самонаводящиеся ракеты. Присоединяясь к чужеродным молекулам и клеткам, антитела делают их узнаваемыми для клеток иммунной системы, с помощью которых они могут быть уничтожены. Антитела стали важнейшей частью современных медицинских и биотехнологий, они используются в научных исследованиях, лечении и диагностике болезней.

Эта лабораторная работа облегчает изучение функций иммунной системы и знакомит вас с уникальными свойствами антител, благодаря которым они нашли столь широкое применение в медицине и биотехнологии.

Что такое ИФА?

ИФА расшифровывается как иммуноферментный анализ. Это удобный тест, основанный на антителах, который используется для диагностики таких заболеваний как атипичная пневмония и ВИЧ, и для того, чтобы отслеживать

распространение патогенных микроорганизмов в пище, воде и воздухе. ИФА также применяется для того, чтобы идентифицировать продукты, изготовленные с использованием генетически модифицированных организмов, аллергены в пище, и молекулярные маркеры беременности и применения наркотиков.

Этот набор позволяет подойти к ИФА с трех разных сторон (см. следующую страницу). Для каждого подхода даны свои учебные материалы, руководства для учителей и учеников. Преподаватели или ученики должны выбрать наиболее подходящий протокол для лабораторной работы.

Исследование под руководством учителя

Задача этих учебных материалов – провести ваших учеников через процесс, имитирующий любое научное лабораторное исследование. У учеников, выполнивших эту работу, развивается уверенность в их способности применять реальные средства научных исследований к важным задачам. Вопросы, приведенные в руководствах для учеников, направлены на то, чтобы максимизировать их вовлеченность в работу. В результате ученики понимают ценность организованного и логически правильного подхода к решению научных задач.

Мы приветствуем ваши идеи и дополнения!

Содержание

Контрольный список() содержания набора 5

Как работает этот набор 6

Введение в ИФА 9

Химическое и биологическое оружие и ИФА 14

Протокол I: ИФА для отслеживания распространения болезни 16

Руководство преподавателя 16

Общий план работы 17

Подготовка преподавателя к лабораторной работе 19

Ответы на вопросы и темы для обсуждения для учителей 24

Лабораторный протокол в картинках 28

Руководство для учеников 32

Введение 32

Лабораторный протокол 37

Протокол II: ИФА для обнаружения антигена 45

Руководство преподавателя 45

Общий план работы 46

Подготовка преподавателя к лабораторной работе 47

Ответы на вопросы и темы для обсуждения для учителей 52

Лабораторный протокол в картинках 55

Руководство для учеников 58

Введение 58

Лабораторный протокол 63

Протокол III: ИФА для обнаружения антител 69

Руководство преподавателя 69

Общий план работы 70

Подготовка преподавателя к лабораторной работе 71

Ответы на вопросы и темы для обсуждения для учителей 76

Лабораторный протокол в картинках 79

Руководство для учеников 82

Введение 82

Лабораторный протокол 88

Приложение А: Иммунологические концепции 95

Приложение Б: Словарь терминов 108

Приложение Г: Дополнения к урокам 119

Полуколичественный ИФА 120

Приложение Д: Библиография 126

Полезные Интернет-ресурсы: 127

Контрольный список() содержания набора

В этом разделе перечислены все компоненты, входящие в состав набора по ИФА и требуемые дополнительные принадлежности. Каждый набор рассчитан на 12 рабочих мест для учеников (максимально до 4 учеников на одно рабочее место). Проверьте с помощью этого списка, все ли у вас есть, перед тем как начать работу.

Компоненты в составе набора	Число/на один набор	()
Антиген, куриный гамма-глобулин	1 флакон	
Первичные антитела, кроличьи поликлональные анти-куриные антитела, лиофилизованные	1 флакон	
Вторичные антитела, козьи анти-кроличьи, коньюгированные с пероксидазой хрена, лиофилизованные	1 флакон	
Субстрат пероксидазы, 3,3’,5,5’-тетраметилбензидин (ТМБ)	1 банка	
10х фосфатно-солевой буфер (phosphate-buffered saline, PBS)	1 банка	
10% Твин 20 (Tween 20)	1 банка	
Одноразовые пластиковые пипетки	80	
Микроплашки со стрипами по 12 лунок	3 плашки с 8 стрипами по 12 лунок	
Желтые микроцентрифужные пробирки, 2 мл	1 упаковка	
Цветные микроцентрифужные пробирки, 2 мл (по 15 зеленого, голубого, оранжевого, фиолетового и коричневого цветов)	1 упаковка	
Необходимые дополнительные принадлежности	Число/на класс	()
Микропипетки на 50 мкл	12	
Наконечники (носики) для пипеток	150	
Бумажные полотенца	4 рулона	
Стаканы на 100-200 мл	12	
50 мл банки или пробирки для реагентов	3	
Фломастеры (черные)	12	
Мерный цилиндр, 100 мл	1	
Мерный цилиндр, 1 литр	1	
Дистиллированная вода	1 литр	
Штативы для микропробирок	12	

Как работает этот набор

С помощью этого набора вы сможете выполнить три различных протокола ИФА: протестировать образец на присутствие антигена (протоколы I и II) или на присутствие антител (протокол III). Положительным контролем на то, что тест работает правильно, является, соответственно антиген или антитело.

Протокол ИФА	Реальное применение	Положительный контроль
Протокол I ИФА для отслеживания распространения болезни Шаг 1: обмен образцами («контакт») между учениками Шаг 2: протокол ИФА для обнаружения антигена Шаг 3: прослеживание распространения «болезни»	Изучение распространения ВИЧ, атипичной пневмонии, простудных заболеваний, оспы, сибирской язвы, гриппа, венерических заболеваний	Антиген
Протокол II ИФА для обнаружения антигена ИФА для обнаружения специфических антигенов в образце	Тесты на беременность, наркотики, наличие аллергенов и продуктов ГМО в пище Тестирование воздуха, воды и пищи Тесты на ВИЧ, оспу, атипичную пневмонию и др.	Антиген
Протокол III ИФА для обнаружения антител Диагностика заболевания по наличию специфических антител в «образце крови» с помощью ИФА	Диагностика ВИЧ, трихинеллеза, атипичной пневмонии и др. по наличию специфических антител в крови	Антитело

Протокол I: ИФА для отслеживания распространения болезни

Заинтересуйте ваших учеников, перед тем как провести ИФА для обнаружения антигена. Ученики должны отследить распространение воображаемой заразной «болезни» в их классе. Начиная с одного или двух случайно выбранных «зараженных», ученики обмениваются образцами («вступают в контакт»). Затем они проводят ИФА и отслеживают распространение «болезни» по классу. Эта игра предоставляет дополнительную возможность обсудить на уроке вопросы здравоохранения и эпидемиологии. Болезни, распространение которых в реальности можно контролировать с помощью подобных протоколов – это ВИЧ, атипичная пневмония, простуда, оспа, сибирская язва, грипп и заболевания, передающиеся половым путем. Как преподаватель, вы сами можете придумать наиболее подходящий для урока и учеников контекст этой задачи.

Протокол II: ИФА для обнаружения антигена

Тест на наличие антигена в «биологическом образце». Этот протокол можно использовать для обсуждения того, как с помощью ИФА можно детектировать болезнь еще до того, как организм выработал определяемый иммунный ответ. Одним из применений такого метода является обнаружение оспы. Если оспа детектирована вовремя и больному введена вакцина в течение 2-3 дней после заражения, то болезнь не развивается. С другой стороны, можно обсудить, как ИФА используется для определения беременности, загрязнения воды и воздуха, обнаружения аллергенов и ГМ-продуктов в пище.

Протокол III: ИФА для обнаружения антител

Тест на присутствие антител к определенным антигенам в воображаемом «образце крови пациента». Этот тип ИФА используется, когда антиген по каким-то причинам невозможно детектировать, или когда организм уже выработал иммунный ответ и в крови есть антитела. Классический пример анализа такого рода – анализ на ВИЧ. До недавнего времени, единственным способом диагностировать ВИЧ на ранней стадии было определение в крови антител к вирусу, а не определение самого вируса. Организм начинает производить антитела к вирусу в количестве, которое можно обнаружить с помощью ИФА, гораздо раньше, чем сам вирус размножится до обнаруживаемого уровня.

Как выбрать протокол?

Мы предоставляем отдельное руководство для каждого протокола, с отдельными блоками для преподавателей и учеников. Учителя или ученики могут сами выбрать наиболее подходящую работу. Три протокола отражают растущую глубину погружения в предмет, от общего знакомства с иммунологией в протоколе I, до подробного изучения механизмов иммунитета в протоколе III. Из-за того, что мы хотели предоставить отдельные руководства для каждого протокола, некоторая информация в них повторяется.

Все три протокола это вариации на одну и ту же тему, но каждый подход показывает ИФА в разном контексте. Чтобы лучше подобрать контекст, ознакомьтесь с введением (ниже) и приложениями А и Б. Приложение В содержит полезную информацию про разные болезни и возможные сценарии для урока.

После того, как вы выберите протокол, прочитайте введение и дальше читайте руководство для вашего протокола.

Вопросы безопасности

В помещении, где проводится работа, нельзя есть, пить, курить и пользоваться косметикой. Рекомендуется использование защитных очков и перчаток. Ученики должны вымыть руки с мылом до и после работы. Если какой-то из растворов попадет в глаза, промойте их водой в течение 15 минут.

Хранение

Откройте набор сразу после получения и храните компоненты на +4°С или при комнатной температуре согласно указаниям.

Пошаговое описание ИФА

Шаг 1: антиген добавляется в лунки плашки и инкубируется для того, чтобы связаться со стенками. Несвязавшийся антиген отмывается от лунок детергентом. Детергент также используется как блокирующий агент, занимая все возможные места для посадки белка на лунках и тем самым предотвращая неспецифическое связывание антитела.

Шаг 2: раствор первичных антител добавляется в лунки и инкубируется, для того, чтобы антитела связались с антигеном. Несвязавшиеся антитела отмываются от лунок

Шаг 3: добавляется раствор конъюгированных с ферментом вторичных антител и инкубируется, для того, чтобы вторичные антитела связались с первичными. Затем несвязавшиеся вторичные антитела отмываются от лунок.

Шаг 4: добавляется хромогенный субстрат фермента и инкубируется для развития окраски. Оцениваются результаты анализа. В лунках, оставшихся бесцветными анализ отрицательный, в лунках, ставших синими – положительный.

Введение в ИФА

Следующий раздел кратко описывает технические и теоретические моменты, непосредственно связанные с данной лабораторной работой. Понимание учениками этих моментов чрезвычайно важно для успеха работы.

Гидрофобными называются взаимодействия двух нерастворимых в воде (жирных) веществ, которые стремятся иметь как можно меньшую границу с водой. Из-за наличия «жирных» (гидрофобных) аминокислот в составе белка, он может частично разворачиваться (денатурировать) и взаимодействовать с гидрофобной поверхностью полистирола.

Плашки для ИФА: плашки сделаны из полистирола, который связывает (адсорбирует) белки из-за гидрофобных взаимодействий. В этом наборе используются 96-луночные плашки, разделенные на 8 снимаемых рядов (стрипов) по 12 лунок. Ученики используют один стрип на двоих. Вместимость каждой лунки около 250 мкл (μl).

Антиген: в этом наборе в качестве антигена используется куриный гамма-глобулин (выделенный из яичных желтков), который в этой работе играет роль любого гипотетического антигена.

Время инкубации: скорость связывания определяется температурой инкубации и концентрациями реагентов. Этот набор оптимизирован так, что каждую инкубацию можно провести за 5 минут при комнатной температуре. Увеличение продолжительности инкубации или температуры приведет к усилению окраски и в частности может привести к возникновению фоновой окраски в контрольных лунках.

Забивка: вещества для забивки добавляются после связывания антигена, чтобы воспрепятствовать неспецифическому связыванию антител с пластиком, что приведет к возникновению ложноположительных результатов. Для забивки может использоваться белок или детергент (или оба вместе). Обычно для этих целей применяют Твин 20 (неионный детергент, используемый в этом наборе), обезжиренное сухое молоко, желатин и бычий сывороточный альбумин (БСА). Хотя в этом протоколе вполне достаточно использовать только Твин 20, вы можете в учебных целях добавить дополнительную стадию забивки: пусть ваши ученики после добавления антигена добавят 50 мкл 1%-го раствора желатина в промывочном буфере и инкубируют 15 минут, потом промоют лунки.

Первичные антитела: первичными антителами называются антитела, которые узнают и связывают антиген. В этом наборе в качестве первичных используются поликлональные кроличьи антитела против гамма-глобулина. В протоколе III эти антитела выступают в качестве «человеческих антител в образце сыворотки крови».

Вторичные антитела: вторичные антитела узнают и связывают первичные антитела. Они выделяются из животных другого вида, чем те, из которых были получены первичные антитела. При создании этого набора, козы были иммунизированы кроличьим иммуноглобулином IgG для того, чтобы получить из их крови вторичные антитела.

Колориметрическое определение: вторичные антитела для ИФА конъюгированы с ферментом, так, что обнаружение вторичных антител, связавшихся с первичными, происходит за счет ферментативной реакции. В этом наборе вторичные антитела конъюгированы с пероксидазой хрена. В присутствии перекиси водорода (H₂O₂) пероксидаза катализирует окисление хромогенного субстрата 3,3’,5,5’-тетраметилбензидина (ТМБ) с образованием синего продукта реакции. Внимание: ТМБ светочувствителен и результаты теста должны определяться через 5-10 минут после добавления субстрата. Если инкубировать стрипы дольше, может развиться неспецифическая окраска – ее не надо учитывать в результатах теста. Через 20-30 минут цвет может поблекнуть из-за того, что ТМБ будет выпадать в осадок.

Колориметрическое определение: окисление ТМБ пероксидазой

Контроли: контроли всегда делаются одновременно с опытными образцами, чтобы удостовериться, что процедура работает нормально. Контроли могут помочь разобраться с неоднозначными результаты, возникающими из-за человеческой ошибки или загрязненных реагентов. Контроли должны быть включены в любые тесты ИФА, чтобы их результаты могли считаться действительными. Для проведения отрицательного контроля, нужно убрать из образца антиген или первичное антитело (как в данной работе), или заменить антиген на другое вещество, которое не связывается специфично с антителами. Положительный контроль всегда содержит предполагаемый антиген и первичные антитела. Отрицательный образец, в котором тест дает положительный результат, называется ложноположительным. Положительный образец, в котором тест дал отрицательные результаты, называется ложноотрицательным. Многие тесты, применяемые в диагностике, дают определенный процент ложноположительных или ложноотрицательных результатов, поэтому важно подтверждение диагноза в другом независимом тесте. Например, тесты на наличие антител к ВИЧ могут давать как ложноположительные, так и ложноотрицательные результаты. Ложноположительные могут возникать от проведенных вакцинаций, а ложноотрицательные – от подавления иммунной системы (например, при приеме лекарств, применяемых при трансплантации) или когда тест сделан слишком рано и инфекция еще не успела развиться (Антитела против ВИЧ появляются в крови через несколько недель после заражения; появление специфических антител называется сероконверсией). Поэтому положительный тест на ВИЧ всегда дополнительно подтверждается вестерн-блотом (см. стр. 105)

В ИФА, аналогичных протоколам I и II (когда экспериментальным параметром является наличие антигена), отрицательным контролем будут являться лунки, не содержащие антигена. Любая окраска, которая разовьется в этих лунках, будет являться следствием: а) неспецифического связывания антител; б) экпериментальной ошибки. Подходящим положительным контролем будет являться образец, заведомо содержащий антиген. В тестах ИФА аналогичных протоколу III (в которых экспериментальным параметрам является наличие первичных антител) отрицательным контролем будут являться лунки, не содержащие первичных антител. Любая окраска, развивающаяся в этих лунках, будет следствием неспецифического связывания вторичных антител, или экспериментальной ошибки. Положительным контролем будет являться образец с добавленными первичными антителами. Специальные контрольные растворы входят в состав многих коммерчески доступных наборов для ИФА, применяемых в клинике.

Анализ результатов: ИФА может дать как качественный (да или нет) так и количественный (сколько) результат. Качественный ответ можно получить на глаз, без помощи специального оборудования. Количественные результаты тоже можно оценить на глаз и отмечать, например (++) – сильный сигнал, (+) – слабый сигнал, (+/-) – сомнительный сигнал, (-) – отсутствие сигнала. Для точного определения концентраций необходим ридер (спектрофотометр) для плашек. Этот прибор измеряет поглощение света с определенной длиной волны в каждой лунке плашки относительно поглощения в контрольных лунках. Пик поглощения синей формы TMБ – 655 нм. Контроли для количественного анализа ИФА включают набор растворов известной концентрации для построения стандартной кривой. Стандартная кривая позволяет количественно определить концентрации антигена в образце, что в свою очередь, помогает исследователю или врачу определить степень развития какого-то инфекционного заболевания. Описание того, как выполнить количественный тест ИФА (без использования спектрофотометра) приведено в приложении Г.

ИФА так часто выполняется в медицинских и научных лабораториях, что существует множество коммерчески доступных наборов для определения разных антигенов. Такие наборы включают все компоненты и контроли, необходимые для проведения теста. Доступны тесты для диагностики аутоиммунных заболеваний, вирусов, бактерий, токсинов, генетических нарушений и.т.п.

Данный учебный набор демонстрирует один из возможных конкретных методов выполнения ИФА. Он относится к группе методов с захватом антитела - когда антиген иммобилизуется на дне лунки, и антитело связывается (оказывается захваченным) антигеном. Вторичные антитела связаны с ферментом пероксидазой хрена, который способен окислять хромогенный субстрат (ТМБ), что приводит к появлению синей окраски.

В тестах, основанных на захвате антигена, на дне лунки иммобилизуются первичные антитела, к которым затем добавляется антиген. В свою очередь, антиген узнается вторичными антителами, так же конъюгированными с пероксидазой, что приводит к развитию синей окраски при добавлении ТМБ.

Применения ИФА

ИФА является не только важнейшим диагностическим средством в медицине, но и применяется во многих других областях, в том числе в ветеринарии, тестировании пищи и сельском хозяйстве. Вот некоторые примеры:

Область	Способ применения
Медицина и ветеринария	Диагностика заболеваний человека, таких как ВИЧ, атипичная пневмония, трихинеллез, туберкулез и др. по наличию антител в крови Диагностика вирусов, таких как вирус лейкемии кошек и вирус кошачьего иммунодефицита у кошек Обнаружение паразитов, таких как кардионематоды у собак Диагностика проблем с щитовидной железой у собак и кошек с помощью измерения концентрации тироксина (t4) в крови Диагностика лошадиного энцефалита у с помощью определения арбовирусов в крови.
Сельское хозяйство	Обнаружение вирусов растений, таких как вирус скручивания листьев картофеля или вирус мозаики огурцов Обнаружение микотоксинов в зерне, например афлатоксинов в зерне и кукурузе. Обнаружение вирусов в декоративных растениях, например желтой мозаики фасоли у гладиолусов Отслеживание подмены не-ГМО злаков генно-модифицированными растениями
Охрана окружающей среды	Тестирование качества воздуха в помещениях, например, обнаружение плесневых токсинов
Качество и безопасность пищевых продуктов	Предотвращение распространения коровьего бешенства с помощью контроля состава мяса. Определение подлинности происхождения продуктов (т.е.определение белков коровьего молока в козьем молоке или белков из не-твердых сортов пшеницы в продуктах из твердых сортов) Предотвращение аллергических реакций с помощью обнаружения не указанных производителем ингредиентов, например следов арахиса в продуктах
Другое	Определение применения запрещенных лекарств и препаратов (допинга, кокаина, марихуаны, амфетаминов) Подтверждение беременности с помощью определения человеческого хорионного гонадотропина (ХГЧ) в моче

Химическое и биологическое оружие и ИФА

В последнее время биологическое оружие стало часто обсуждаться в средствах массовой информации, поэтому мы включили небольшой раздел, посвященный биологическому оружию.

Человек использует биологическое оружие уже давным-давно. В 6 веке до нашей эры ассирийцы отравляли колодцы своих врагов спорыньей; аналогично афиняне отравляли вражеские источники воды растением, имеющим слабительное действие. В 18 веке вожди американских индейцев получали в подарок одеяла, снятые с оспенных больных, что вызывало массовые эпидемии. В более недавнее время болгарский диссидент-перебежчик Георгий Марков был убит в Лондоне с помощью рицина (токсина из касторовых бобов). Он был уколот в ногу с помощью острого наконечника зонтика, пока ждал автобуса на остановке. В 2001 году в США в новостные агентства и правительственные учреждения по почте рассылались споры сибирской язвы.

Во время любой биологической атаки, важнейшей задачей является скорейшее обнаружение и идентификация биологического агента и связанной с ним болезни. Необходимо распознать источник заболевания и определить, кто был инфицирован, чтобы предоставить им лечение и/или изолировать. Например, если инфекция оспой будет обнаружена в течение 2-3 дня после заражения, и будет введена вакцина, заболевание не разовьется. Вакцинация в течение 4-5 дней после заражения может предотвратить фатальный исход. Тем не менее, вакцинация против оспы сама по себе сопряжена с риском, поэтому встает вопрос о том, нужно ли иммунизировать не зараженных людей.

Американский центр по контролю и предотвращению болезней разделяет возбудителей заболеваний и токсины, которые могут быть применены в качестве оружия, на три группы по степени опасности, в основном исходя из легкости распространения.

К первой группе относятся легко распространяющиеся болезни с высокой степенью смертности, способные вызвать панику среди людей. Примерами являются сибирская язва (Bacillus anthracis), ботулизм (Clostridium botulinum toxin), чума (Yersinia pestis), оспа (Variola major), туляремия (Francisella tularensis) и вирусные геморрагические лихорадки (вызванные филовирусами, например Эбола и Марбург и аренавирусами, например Ласса и Мачупо)

Ко второй группе относятся заболевания, которые легче лечатся и не настолько смертоносны, такие как бруцеллез (Brucella sp), отравления токсином эпсилон Clostridia perfringens, пищевые отравления (Salmonella sp, Escherichia coli O157:H7, Shigella sp), сап (Burkholderia mallei), мелиоидоз (Burkholderia pseudomallei), орнитоз (Chlamydia psittaci), ку-лихорадка (Coxiella burnetii), отравление рицином из касторовых бобов (Ricinus communis), отравление стафилококковым энтеротоксином Б, сыпной тиф (Rickettsia prowazekii), вирусные энцефалиты, вызванные альфавирусами (например, венесуэльский лошадиный энцефалит, восточный лошадиный энцефалит и западный лошадиный энцефалит) и патогены, распространяющиеся в воде (Vibrio cholerae, вызывающий холеру и Cryptosporidium parvum, вызывающий криптоспоридиоз)

К последней категории относятся патогены, которые могут стать угрозой в будущем, например вирус Нипах и хантавирусы (вирусы животных, передающиеся людям).

Диагностика и идентификация биологических агентов является важной частью ответа на биологическую атаку. Также важными являются планы по предотвращению таких атак и готовности к ним и здесь важной частью является образование.

Протокол I: ИФА для отслеживания распространения болезни

Руководство преподавателя

Этот протокол сопровождает ИФА игрой, в которой ученики должны обмениваться своими образцами, моделируя «распространение болезни». Каждому ученику дается образец, один или два из которых «заражены» (т.е. содержат антиген). После того как ученики совершат ряд обменов образцами («контактов») со своими товарищами, они тестируют их с помощью ИФА. Оказывается, что у большей части класса анализ положительный! Таким образом, ученики получают представление о том, как болезнь распространяется в популяции и оказываются заинтересованы этим вопросом. Этот протокол имитирует распространение таких болезней как атипичная пневмония, простуда, грипп, ВИЧ и заболеваний, передающихся половым путем. В приложении С приведены описания некоторых болезней и возможные «сценарии» для лабораторной работы. Разумеется, можно провести работу и не указывая конкретную «болезнь».

План уроков

Урок 1	Подготовка к работе	Лекция и обсуждение
Урок 2	Обмен образцами между учениками	Лабораторная работа по ИФА
Урок 3	Анализ результатов ИФА	Отслеживание распространения болезни

Общий план работы

Ш аг 1: ученики «контактируют» друг с другом, смешивая свой образец с образцами других учеников. Двое учеников смешивают свои образцы и каждый забирает половину смешанного образца. Каждый ученик обменивается один или два раза (в зависимости от размера класса) и записывает имена тех, с кем обменялся.

Шаг 2: с помощью микропипетки 50 мкл из образца каждого ученика, вместе с положительным и отрицательным контролями, добавляется в лунки плашки и инкубируется 5 минут, чтобы дать возможность белкам в составе образца связаться со стенками лунки. Затем лунки промываются промывочным буфером (PBST: фосфатно-солевой буфер, содержащий 0.05% Твин 20) который кроме того блокирует оставшиеся свободными возможные места связывания для белков в лунке.

Шаг 3: в каждую лунку добавляется 50 мкл раствора первичных антител и инкубируется 5 мин при комнатной температуре. Первичные антитела узнают антигены («возбудителей болезни») и связываются с ними. Затем лунки опять промываются промывочным буфером, чтобы удалить несвязавшиеся антитела.

Шаг 4: в каждую лунку добавляется 50 мкл раствора вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой и инкубируется 5 мин. Вторичные антитела узнают первичные антитела и связываются с ними. Пероксидаза это фермент, который окисляет хромогенный субстрат, что изменению его цвета. Лунки промываются PBST чтобы удалить несвязавшиеся вторичные антитела.

Шаг 5: в каждую лунку добавляется 50 мкл раствора субстрата (ТМБ) и ученики наблюдают за развитием окраски. Если в образце присутствовал антиген, то в данной лунке также будет присутствовать пероксидаза, и в течение 5 минут раствор в лунке посинеет. Если антигена в образце не было, раствор останется бесцветным.

Т ипичные результаты ИФА

Использование результатов анализов для того, чтобы проследить «распространение болезни».

Число положительных результатов в классе будет зависеть от того, сколько образцов, содержащих антиген, было с самого начала. Вы можете отследить как «болезнь» распространяется по классу.

Вы можете попросить ваших учеников, чтобы они сами придумали, как именно отследить распространение болезни, или воспользоваться таблицей для результатов, приведенной в руководстве для учеников. Нарисуйте таблицу на доске (или воспользуйтесь проектором). Попросите каждого ученика подойти и написать (+) или (-) в столбце с результатами ИФА. В зависимости от этого они также пишут (+) или (-) напротив имен тех, с которыми они менялись. Например, если результат Саши положительный, и он менялся с Ваней, Катей и Ильдаром, он пишет (+) напротив своего имени и напротив имен Вани, Кати и Ильдара. Ученики, напротив имен которых будет больше всего плюсов, выявляются как ранние источники инфекции.

Вопрос: почему невозможно отследить инфекцию до одного-единственного ученика?

Ответ: когда ученик, исходно бывший источником инфекции, обменивается своим образцом с товарищем, напротив имени последнего будет стоять столько же плюсов. Это проблема, с которой эпидемиологи сталкиваются при решении реальных задач. Именно поэтому им зачастую приходится изучать истории болезней, места нахождения пациентов и их поведение. Вы также можете попросить учеников провести более подробный анализ, например вспомнить ,в каком порядке происходил обмен образцами.

У эпидемиологов редко бывают данные анализов пациентов до вспышки болезни и редко когда им удается проследить источник заболевания до конкретного человека. У вас есть преимущество: вы знаете, кто получил «инфицированные» образцы. Вы можете определить, насколько близки к истине оказались догадки ваших учеников.

Подготовка преподавателя к лабораторной работе

Этот раздел предназначен для того, чтобы вы хорошо подготовились к предстоящей работе. Мы рекомендуем вам прочитать все руководство (Протокол I) перед тем, как приступать к работе. Используйте информацию из приложения В, если вы хотите использовать сценарий урока, связанный с конкретной болезнью.

Самым важным для успеха работы будет, чтобы ученики капали в лунки нужные растворы в нужном порядке, поэтому подписывайте пробирки четко и понятно. Используйте пробирки разных цветов, как указано ниже.

Задачи

Шаг 1 Приготовить буферные растворы

Шаг 2 Приготовить 50x стоковые растворы антитела, первичных и вторичных антител

Шаг 3 Развести стоковые растворы

Шаг 4 Приготовить порции (аликвоты) растворов для рабочих мест учеников

Шаг 5 Подготовить рабочие места

Необходимое время

1-3 часа

Мы рекомендуем разводить сухой антиген и первичные антитела не раньше чем за 3 дня до начала работы, а вторичные антитела – в течение 24 часов перед началом работы. Также мы рекомендуем использовать стерильную дистиллированную воду для приготовления однократного PBS, чтобы избежать заражения реагентов. Растворы антител и антигена должны храниться на льду или на +4°С в холодильнике, если они приготовлены более чем за 4 часа до начала работы.

Внимание: если вы планируете использовать набор для проведения нескольких занятий в течение 1-2 недель, мы настоятельно рекомендуем использовать стерильную воду для приготовления PBS! Воду можно стерилизовать в 5-минутным кипячением в микроволновой печи в неплотно закрытой бутылке; когда вы вынете бутылку из микроволновки, дайте ей остыть, потом закрутите крышку. Разводите концентрированные растворы антигена и антител строго в том количестве, какое вам потребуется для урока. Оставшиеся стоковые растворы храните в холодильнике на 4°С, их можно использовать в течение двух недель. Не замораживайте растворы.

Измерение объема

Этот набор содержит одноразовые пластиковые пипетки для измерения объемов от 250 мкл до мл. Соответствующие отметки на пипетке показаны на рисунке. Чтобы добавить несколько миллилитров, просто добавьте нужное число раз по миллилитру. Вам также понадобятся микропипетки для добавления объема в 50 мкл. Для каждого шага подготовки к работе, используйте новую одноразовую пипетку или чистый носик для микропипетки.

Для измерения объема пенящихся жидкостей, содержащих детергент, отмеривайте объем по границе жидкости и пузырей.

Протокол I: пошаговое руководство для подготовки

Рассчитано на подготовку 12 рабочих мест, каждое для 4 учеников

Реагенты в составе набора	Необходимое количество
Антиген, куриный гамма-глобулин, сухой	1 флакон
Первичные антитела, кроличьи анти-куриные поликлональные антитела, сухие	1 флакон
Вторичные антитела, козьи анти-кроличьи антитела, конъюгированные с пероксидазой, сухие	1 флакон
Субстрат пероксидазы (ТМБ)	1 банка
10х фосфатно-солевой буфер (PBS)	1 банка
10% Твин 20	1 банка
Дополнительные реагенты
Дистиллированная вода (рекомендуется стерильная вода)	1 л

Шаг 1. Приготовьте буферные растворы

Мы рекомендуем вам использовать градуированные цилиндры на 100 мл и на 1 л для приготовления растворов. Вам также понадобится 1 л дистиллированной воды.

Буфер	Объем	Реагент	Используется для
1х PBS, 100 мл	90 мл	Дистиллированная вода	Приготовления стоковых (50x) растворов антигена, первичных и вторичных антител Разведение антигена для приготовления «зараженных» образцов и положительного контроля Отрицательный контроль Отрицательные образцы учеников
	10 мл	10х PBS
Промывочный буфер, 900 мл	805 мл	Дистиллированная вода	Разведение 50x растворов антител Промывка плашек
	90 мл	10х PBS
	4.5 мл	10% Твин 20

Шаг 2. Приготовьте стоковые растворы антигена и антител

Осторожно откройте флаконы с лиофилизованными антигеном и антителами и чистой пипеткой добавьте 0.5 мл 1x PBS в каждый из них. Закройте флаконы и хорошо перемешайте. Получившиеся растворы это 50-кратные концентраты, или «стоковые» растворы. Внимание: на этом этапе не используйте промывочный буфер.

Шаг 3. Разведите 50-кратные растворы

Подготовьте по 50 мл бутылке или пробирке для каждого из растворов. Используйте чистую пипетку, чтобы добавить нужное количество концентрированного стокового раствора в соответствующую бутылку или пробирку.

Раствор	Объем	Реагент	Используется для
Положительный контроль (1х антиген)	7.5 мл	1х PBS	Положительный контроль
	150 мкл	50x антиген
	Внимание: не добавляйте раствор, содержащий Твин 20 в раствор антигена, иначе эксперимент не будет работать
1х раствор первичных антител	24.5 мл	Промывочный буфер	Первичные антитела
	0.5 мл	50х кратный раствор первичных антител
	С помощью пипетки промойте флакон с 50х раствором антител приготовленным однократным раствором, чтобы смыть остатки стокового раствора со стенок Закройте бутыль или пробирку с приготовленным раствором крышкой и хорошо перемешайте
1х раствор вторичных антител	24.5 мл	Промывочный буфер	Вторичные антитела
	0.5 мл	50х раствор вторичных антител
	Разводите вторичные антитела не ранее чем за сутки до начала работы С помощью пипетки промойте флакон с 50х раствором антител приготовленным однократным раствором, чтобы смыть остатки стокового раствора со стенок Закройте бутыль или пробирку с приготовленным раствором крышкой и хорошо перемешайте

Шаг 4. Приготовьте аликвоты растворов для обеспечения всех рабочих мест

Пробирки		Описание	Подписать				Содержимое
Фиолетовые пробирки, 12 шт		Положительный контроль	«+»				0.5 мл раствора антигена (положительный контроль)
Синие пробирки, 12 шт		Отрицательный контроль	«-»				0.5 мл 1х PBS
Зеленые пробирки, 12 шт		Первичные антитела	«П.А.»				1.5 мл 1х раствора первичных антител
Оранжевые пробирки, 12 шт		Вторичные антитела	«В.А.»				1.5 мл 1х раствора вторичных антител
Коричневые пробирки, 12 шт		Субстрат пероксидазы (ТМБ)	«Субстрат»				1.5. мл раствора ТМБ
		Внимание: ТМБ чувствителен к свету, поэтому важно хранить его именно в темных пробирках.
Желтые пробирки, число зависит от числа учеников (1-3 шт)	«Зараженный» образец (6.6х раствор антигена)			Выберите сами		100 мкл 50х раствора антигена
						650 мкл 1х PBS
	Количество «зараженных» образцов, которые вы смешаете с чистыми, зависит от числа учеников в классе. Для того, чтобы примерно половина класса оказалась «заражена», используйте 1 «зараженный» образец на 16 учеников. (если ваш класс меньше 10 учеников, возьмите один образец и выполните 2 раунда обменов). Не добавляйте раствор, содержащий Твин 20 к растворам антигена, или эксперимент не будет работать. Вы можете хранить «зараженные» образцы отдельно от чистых до начала урока, чтобы отследить, кто их получил.
Желтые пробирки, по числу учеников	«Чистые» образцы		Выберите сами*		750 мкл 1х PBS
	Сделайте требуемое количество образцов, не содержащих антиген (количество учеников минус количество «зараженных образцов) Внимание: используйте PBS, а не промывочный буфер, иначе эксперимент не получится
* Вы можете подписать все пробирки, чистые и содержащие антиген, цифрами, например, от 1 до 48, и отметить, какие из них содержат антиген.

Шаг 5. Подготовьте рабочие места учеников

Список для проверки рабочих мест. Одно рабочее место рассчитано на 4 учеников

Предмет	Содержимое	Количество	()
Желтые пробирки	Образцы для анализа (0.75 мл)	4 шт (по 1 на ученика)	
Фиолетовая пробирка (+)	Положительный контроль (0.5 мл)	1 шт	
Синяя пробирка (-)	Отрицательный контроль (0.5 мл)	1 шт	
Зеленая пробирка (П.А.)	Первичные антитела (1.5 мл)	1 шт	
Оранжевая пробирка (В.А.)	Вторичные антитела (1.5 .мл)	1 шт	
Коричневая пробирка (Субстрат)	Субстрат пероксидазы (ТМБ) 1.5 мл	1 шт	
12-луночные стрипы		2 шт	
Микропипетка		1 шт	
Желтые носики для микропипетки		10-20 шт	
Одноразовые пластиковые пипетки		5 шт	
70-80 мл промывочного буфера в стакане	Фосфатно-солевой буфер (PBS), содержащий 0.05% Твин 20	1 шт	
Большая пачка бумажных полотенец		2	
Черный фломастер (маркер)		1 шт	

Замечания по обмену образцами: проследите, чтобы ученики менялись образцами в разных частях класса, а не с соседями. Лучше всего сделать это в виде раундов: каждый встает и совершает один «контакт» с кем-то другим ,потом садится на свое место. Потом еще один раунд обменов и.т.п. Сколько потребуется раундов, зависит от вашего класса: мы рекомендуем использовать 1 «инфицированный» образец на 16 человек. Если в вашем классе менее 10 человек, то используйте 1 «инфицированный» образец и два раунда обменов.

Где можно остановиться: эта работа может быть выполнена за один урок, но вы можете остановить ее после того как ученики обменяются образцами и положить все реагенты в холодильник на +4ºС на ночь. Вы также можете остановиться в любом месте, добавив буфер для промывки в лунки (после добавления антигена и перед добавлением субстрата пероксидазы) и убрать все реагенты и плашки на +4ºС

Ответы на вопросы и темы для обсуждения для учителей

Вопросы до лабораторной работы