Лабораторно-практичне заняття 8-9.

Препарат

Сірчана кислота, хлороформ

Дезоксикортикостерону ацетат

Кортизону ацетат

Гідрокортизону ацетат

Преднізолон

Преднізон

Дексаметазон

Прогестерон

Прегнін

Метилтестостерон

Метандростенолон

Метиландростендіол

Етинілестрадіол

Хід роботи

Рівняння реакції, розрахунки, спостереження

Дослід . Провести ідентифікацію гідрокортизону ацетату відповідно до ДФУ.

В. Визначення проводять методом тонкошарової хроматографії, використовуючи як тонкий шар підхожий силікагель із флуоресцентним індикатором з оптимальною інтенсивністю поглинання за довжини хвилі 254 нм.

Випробовуваний розчин. 10 мг субстанції розчиняють у суміші метанол Р – метиленхлорид Р (1:9) і доводять об’єм розчину тією самою сумішшю розчинників до 10 мл.

Розчин порівняння (а). 20 мг ФСЗ гідрокортизону ацетату розчиняють у суміші метанол Р – метиленхлорид Р (1:9) і доводять об’єм розчину тією самою сумішшю розчинників до 20 мл.

Розчин порівняння (b). 10 мг кортизону ацетату Р розчиняють у розчині порівняння (а) і доводять об’єм розчину тим самим розчинником до 10 мл.

На лінію старту хроматографічної пластинки наносять 5 мкл (5 мкг) випробовуваного розчину, 5 мкл (5 мкг) розчину порівняння (а), 5 мкл (5 мкг гідрокортизону ацетату і 5 мкг кортизону ацетату) розчину порівняння (b). Пластинку поміщають у камеру з рухомою фазою, приготованою шляхом додавання суміші вода Р – метанол Р (1.2:8) до суміші ефір Р – метиленхлорид Р (15:77). Коли фронт розчинників пройде 15 см від лінії старту, пластинку виймають із камери, сушать на повітрі і переглядають в УФ-світлі за довжини хвилі 254 нм.

На хроматограмі випробовуваного розчину має виявлятися основна пляма на рівні основної плями на хроматограмі розчину порівняння (а), відповідна їй за розміром.

Потім пластинку обприскують розчином кислоти сірчаної спиртовим Р, нагрівають при температурі 120 °С протягом 10 хв. або до появи плям. Пластинку охолоджують і переглядають при денному світлі й в УФ-світлі за довжини хвилі 365 нм.

На хроматограмі випробовуваного розчину має виявлятися основна пляма на рівні основної плями на хроматограмі розчину порівняння (а), відповідна їй за розміром, забарвленням при денному світлі та за флуоресценцією в УФ-світлі за довжини хвилі 365 нм.

Результати аналізу вважаються вірогідними, якщо на хроматограмі розчину порівняння (b) виявляються дві чітко розділені плями.

D. Близько 2 мг субстанції розчиняють у 2 мл кислоти сірчаної Р і перемішують до розчинення; протягом 5 хв. з’являється інтенсивне коричнювато-червоне забарвлення із зеленою флуоресценцією, особливо інтенсивною при перегляді в УФ-світлі за довжини хвилі 365 нм. Одержаний розчин додають до 10 мл води Р і перемішують; розчин знебарвлюється, а флуоресценція не зникає.

Дослід 2. Провести ідентифікацію преднізолону.

Методика ДФ Х.

1 мг препарату розчиняють в 1 мл метанолу, додають 5 мл розчину сульфату фенілгідразину і нагрівають на водяній бані; через 5 хв. утворюється жовте забарвлення.

0,01 г препарату розчиняють в 1 мл метанолу, додають 1 мл реактиву Фелінга і нагрівають на водяній бані; утворюється червоно-оранжевий осад.

1 мг препарату розчиняють в 2 мл концентрованої сірчаної кислоти; через декілька хвилин утворюється червоне забарвлення.

Дослід 3. Провести ідентифікацію бетаметазону дипропіонату відповідно до ДФУ.

А. 10.0 мг субстанції розчиняють в етанолі Р і доводять об’єм розчину тим самим розчинником до 100.0 мл. 2.0 мл одержаного розчину поміщають у пробірку із притертою скляною пробкою, додають 10.0 мл розчину фенілгідразину в кислоті сірчаній Р, перемішують, нагрівають у водяній бані при температурі 60 °С протягом 20 хв. і відразу охолоджують. Оптична густина одержаного розчину за довжини хвилі 419 нм не має перевищувати 0.10.

С. Визначення проводять методом тонкошарової хроматографії, використовуючи як тонкий шар підхожий силікагель із флуоресцентним індикатором з оптимальною інтенсивністю поглинання за довжини хвилі 254 нм.

Випробовуваний розчин. 10 мг субстанції розчиняють у суміші метанол Р — метиленхлорид Р (1:9) і доводять об’єм розчину тією самою сумішшю розчинників до 10 мл.

Розчин порівняння (а). 10 мг ФСЗ бетаметазону дипропіонату розчиняють у суміші метанол Р – метиленхлорид Р (1:9) і доводять об’єм розчину тією самою сумішшю розчинників до 10 мл.

Розчин порівняння (b). 10 мг ФСЗ дезоксикортону ацетату розчиняють у суміші метанол Р – метиленхлорид Р (1:9) і доводять об’єм розчину тією самою сумішшю розчинників до 10 мл. 5 мл одержаного розчину доводять розчином порівняння (а) до об’єму 10 мл.

На лінію старту хроматографічної пластинки наносять 5 мкл (5 мкг) випробовуваного розчину, 5 мкл (5 мкг) розчину порівняння (а), 5 мкл (2.5 мкг дезоксикортону ацетату і 2.5 мкг бетаметазону дипропіонату) розчину порівняння (b). Пластинку поміщають у камеру з рухомою фазою, приготованою шляхом додавання суміші вода Р – метанол Р (1.2:8) до суміші ефір Р – метиленхлорид Р (15:77). Коли фронт розчинників пройде 15 см від лінії старту, пластинку виймають із камери, сушать на повітрі та переглядають в УФ-світлі за довжини хвилі 254 нм.

На хроматограмі випробовуваного розчину має виявлятися основна пляма на рівні основної плями на хроматограмі розчину порівняння (а), відповідна їй за розміром.

Потім пластинку обприскують розчином кислоти сірчаної спиртовим Р, нагрівають при температурі 120 °С протягом 10 хв. або до появи плям. Пластинку охолоджують і переглядають при денному світлі й в УФ-світлі за довжини хвилі 365 нм.

На хроматограмі випробовуваного розчину має виявлятися основна пляма на рівні основної плями на хроматограмі розчину порівняння (а), відповідна їй за розміром і забарвленням при денному світлі та за флуоресценцією в УФ-світлі за довжини хвилі 365 нм.

Результати аналізу вважаються вірогідними, якщо на хроматограмі розчину порівняння (b) виявляються дві чітко розділені плями.

Е. Близько 2 мг субстанції розчиняють у 2 мл кислоти сірчаної Р і перемішують до розчинення; протягом 5 хв. з’являється червонясто-коричневе забарвлення. До одержаного розчину додають 10 мл води Р і перемішують; розчин знебарвлюється і залишається прозорим.

Дослід 4. Провести ідентифікацію прогестерону.

Методика ДФ Х. 5 мг препарату розчиняють у 2 мл концентрованої сірчаної кислоти, додають 1,5 мл води, струшують, додають ще 1,5 мл води і знову струшують, утворюється жовте забарвлення із зеленою флуоресценцією. Розчин охолоджують, додають 3 мл хлороформу і струшують, обидва шари безбарвні.

2-3 мг препарату розчиняють в 1 мл 95% спирту, додають 1 мл 1% розчину м-динітробензолу в 95% спирті і 1 мл розчину їдкого натру, утворюється рожеве забарвлення, яке поступово переходить у червоно-коричневе.

Дослід 5. Провести ідентифікацію прегніну.

Методика ДФ Х.

2 мг препарату розчиняють в 2 мл концентрованої сірчаної кислоти, додають 1,5 мл води, струшують, додають ще 1,5 мл води і знову струшують; утворюється малинове забарвлення із зеленою флуоресценцією. Розчин охолоджують, додають 3 мл хлороформу і енергійно струшують; нижній шар забарвлюється в оранжевий колір, верхній – майже безбарвний.

Дослід 6. Провести ідентифікацію тестостерону пропіонату.

Методика ДФ Х.

0,05 г препарату розчиняють в 5 мл спирту, додають 1 мл лужного розчину гідроксиламіну гідрохлориду, струшують і залишають на 5 хв. потім рожають 2 мл розведеної соляної кислоти, струшують і приливають 0,5 мл 10% розчину хлориду окисного заліза в 0,1 н розчині соляної кислоти; утворюється червоно-коричневе забарвлення.

Дослід 7. Провести ідентифікацію метандростенолону.

Методика ДФ Х.

2 мг препарату розчиняють в 2 мл концентрованої сірчаної кислоти; утворюється червоне забарвлення.

0.05 г препарату розчиняють у пробірці в 9 мл метилового спирту і додають 1 мл розчину 2,4-динітрофенілгідразину. При потиранні паличкою стінки пробірки утворюється оранжево-червоний осад.

Дослід 8. Провести ідентифікацію етинілестрадіолу.

Методика ДФ Х.

2 мг препарату розчиняють в 2 мл концентрованої сірчаної кислоти; розчин забарвлюється в оранжево-червоний колір і у відбитому світлі має жовто-зелену флуоресценцію. До 1 мл одержаного розчину додають 1 краплю розчину залізоамонійних галунів і 2 мл води; розчин темніє і утворюється червонувато-коричневий осад

Дослід 9. Провести ідентифікацію синестролу.

Методика ДФ Х.

1-2 мг препарату розчиняють при нагріванні в 4 мл хлороформу, додають 2 мл концентрованої сірчаної кислоти, 2 краплі формаліну і збовтують; утворюється вишнево-червоне забарвлення нижнього шару.

Дослід 10. Провести кількісне гідрокортизону ацетату відповідно до ДФУ.

0.100 г субстанції розчиняють у 96 % спирті Р і доводять об'єм розчину тим самим розчинником до 100.0 мл. 2.0 мл одержаного розчину доводять 96 % спиртом Р до об'єму 100.0 мл. Оптичну густину одержаного розчину вимірюють у максимумі за довжини хвилі 241.5 нм.

Вміст С₂₃Н₃₂О₆ обчислюють, використовуючи питомий показник поглинання, що дорівнює 395.

Дослід 11. Провести кількісне преднізолону відповідно до ДФУ.

0.100 г субстанції розчиняють у 96% спирті Р і доводять об'єм розчину тим самим розчинником до 100.0 мл. 2.0 мл одержаного розчину доводять 96 % спиртом P до об'єму 100.0 мл. Оптичну густину (2.2.25) одержаного розчину вимірюють у максимумі за довжини хвилі 243.5 нм.

Вміст С₂₁Н₂₈О₅ обчислюють, використовуючи питомий показник поглинання, що дорівнює 415.

Дослід 12. Провести кількісне бетаметазону дипропіонату відповідно до ДФУ.

50.0 мг субстанції розчиняють у 96 % спирті Р і доводять об'єм розчину тим самим розчинником до 100.0 мл. 2.0 мл одержаного розчину доводять 96 % спиртом Р до об'єму 50.0 мл. Оптичну густину одержаного розчину вимірюють у максимумі за довжини хвилі 240 нм.

Вміст С₂₈Н₃₇РО₇ обчислюють, використовуючи питомий показник поглинання, що дорівнює 305.

Дослід 13. Провести кількісне визначення вмісту тестостерону пропіонату у субстанції відповідно до ДФУ.

25.0 мг субстанції розчиняють в етанолі Р і доводять об'єм розчину тим самим розчинником до 250.0 мл.

10.0 мл одержаного розчину доводять етанолом Р до об'єму 100.0 мл. Оптичну густину (2.2.25) одержаного розчину вимірюють у максимумі за довжини хвилі 240 нм.

Вміст С₂₂Н₃₂Оз обчислюють, використовуючи питомий показник поглинання, що дорівнює 490.

Дослід 14. Провести кількісне визначення вмісту синестролу в розчині для ін’єкцій.

Методика ДФ Х.

Близько 0,35 г препарату (точна наважка) зважують в склянці і розчиняють в 10 мл бензолу. Розчин переносять в ділильну воронку, промиваючи склянку 10 мл бензолу, додають туди ж 50 мл 2,5% розчину їдкого натру, що містить 5 г хлориду натрію, і обережно струшують протягом 15 хвилин. Після розділення шарів, водно-лужний шар фільтрують через невеликий фільтр в колбу приладу для бромування на 250 мл з притертою пробкою. Бензольний розчин промивають ще 10 мл також ж розчину їдкого натру і фільтрують через той же фільтр в ту ж колбу. Потім до одержаного розчину додають 25 мл спирту, 10 мл розведеної сірчаної кислоти, 25 мл 0,02 н розчину бромату калію, 0,2 г броміду калію, перемішують до його розчинення і поміщають колбу у водяну баню при 8-10 С на 15 хв. на горло колби надягають насадку і через неї приливають 20 мл розведеної сірчаної кислоти, охолодженої попередньо до такої ж температури, кран насадки швидко перекривають, вміст колби перемішують і залишають =на 3 хв. в тих же умовах. Після чого додають із насадки 10 мл 2% розчину йодиду калію і через 5 х. відтитровують йод, що виділився, 0,02 н розчином тіосульфату натрію (індикатор – крохмаль).

Паралельно проводять контрольний дослід.

1 мл 0,02 н розчину бромату калію відповідає 0,0006759 г С₁₈Н₂₂О₂, якого в 1 мл препарату повинно бути 0,018-0,022 г.