МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ ТА МОЛОДІ І СПОРТУ УКРАЇНИ

Національний лісотехнічний університет України

Кафедра лісових культур та лісової селекції

Олег Тадейович Данчук

МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ

для лабораторних занять та самостійної роботи

з дисципліни "Лісова селекція з основами генетика"

напрямку підготовки 6.090103

"Лісове та садово-паркове господарство”

Частина 1. Генетика

Львів – 2012

Методичні вказівки розглянуто на засіданні кафедри лісових культур і лісової селекції (протокол № … від 200 р.), методичною радою лісогосподарського факультету Національного лісотехнічного університету України (протокол № від 200 р.) та рекомендовано до друку і використання в навчальному процесі.

Автор – кандидат сільськогосподарських наук, доцент кафедри лісових культур та лісової селекції Національного лісотехнічного університету України О.Т. Данчук

Рецензенти – доктор біологічних наук, професор, завідувач кафедри лісівництва Національного лісотехнічного університету України

Г.Т. Криницький;

кандидат сільськогосподарських наук, професор, завідувач кафедри генетики, селекції та захисту рослин Львівського Національного аграрного університету

П.Д.Завірюха

Вступ

Предмет «Лісова селекція з основами генетики», вивчення якого є важливою складовою частиною підготовки фахівців лісового господарства, об’єднує дві наукові дисципліни. Перша з цих дисциплін має професійно орієнтоване спрямування. Це лісова селекція - наука, яка вивчає способи та методи покращення кількісних і якісних показників деревних порід, а також створення нових сортів на основі цілеспрямованого використання явищ спадковості, мінливості та управління ними. Теоретичною основою лісової селекції є генетика, що будучи дисципліною біологічного спрямування, як самостійна наука ставить за мету вивчення закономірностей в явищах спадковості та мінливості організмів і розкриття їх біохімічної природи.

Переведення лісовирощування на селекційну основу ‒ це сучасний науково обгрунтований шлях збільшення комплексної продуктивності та якісних характеристик лісів за умови одночасного забезпечення біологічної стійкості деревостанів та виконання ними інших економічних, екологічних та соціально важливих функцій. Вивчення селекції як навчальної дисципліни є невід'ємною складовою частиною підготовки кваліфікованих фахівців лісового господарства, а набуті ними знання обов’язково матимуть застосування в майбутній практичній роботі.

Метою вивчення дисципліни студентами лісогосподарського факультету є набуття комплексу знань про закономірності спадковості та мінливості на всіх рівнях організації живого та використання цих знань в практиці ведення лісового господарства.

У процесі вивчення дисципліни студент повинен оволодіти науковими основами генетики та лісової селекції і набути фундаментальних, предметно-видових, загально-функціональних та виховних знань і вмінь, серед яких основними є такі:

‒ розуміння біологічних механізмів передачі спадкових ознак від батьківських рослин до потомства, джерел та факторів генотипової і фенотипової мінливості організмів та практичного їх використання в селекційному процесі;

‒ оволодіння загальною схемою селекційного процесу на основі використання методів добору, гібридизації, мутагенезу, поліплоїдії, генетичної інженерії; пізнання шляхів і методів переведення лісового насінництва на генетико-селекційну основу;

‒ вміння виявляти різновиди, форми, біотопи, які мають господарську цінність;

‒ вивчення порядку організації, технології виконання робіт, ведення документації під час проектування та створення об’єктів лісонасіннєвої бази;

‒ набуття практичних навиків проведення генетичного аналізу вихідного селекційного матеріалу, прогнозування успадкування ознак та властивостей організмів, визначення генотипової та фенотипової складових мінливості та спадковості, розрахунків щодо стану та змін генетичної структури популяцій, проектування генетико-селекційних об’єктів і т.ін.

Виконаня комплексу лабораторних занять в процесі вивчення дисципліни допоможе студентам краще засвоїти теоретичний лекційний матеріал та набути необхідних професійних навиків.

Практичне заняття № 1

БУДОВА ТА ФУНКЦІЇ НУКЛЕЇНОВИХ КИСЛОТ.

ОРГАНІЗАЦІЯ ГЕНЕТИЧНОГО МАТЕРІАЛУ

Мета заняття: вивчити види, особливості будови та функції нуклеїнових кислот; склад хроматину та морфологію хромосом; засвоїти основні генетичні поняття, які використовують для характеристики хромосомного набору виду (організму).

У всіх видів організмів функцію носіїв спадкової інформації виконують нуклеїнові кислоти в формі молекул дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК) і лише у окремих вірусів- рибонуклеїнової кислоти (РНК). За своєю хімічною природою нуклеїнові кислоти- високомолекулярні біополімери, що структурно складаються з нуклеотидів.

У будові нуклеотидів виділяють три основні складові частини: азотисту основу, дезоксирибозу ( молекули ДНК) або рибозу (молекули РНК) та залишок фосфорної кислоти. Нуклеотиди, послідовно з’єднуючись, формують поліонуклеотидні ланцюги (рис. 1).

При цьому молекули ДНК‒ дволанцюгові, а РНК‒ одноланцюгові. Структурно молекули ДНК складаються з таких типів нуклеотидів: аденіну, тиміну, гуаніну та цитозину. У молекулах РНК аденін, цитозин та гуанін доповнює урацил.

Рис.1. Схема будови полінуклеотидних ланцюгів молекули ДНК.

Формування в структурі молекул ДНК та РНК поліонуклеотидних ланцюгів можливе на основі т.з. «фосфодиефірних містків».

Особливістю будови ДНК є наявність в її структурі двох комплементарних поліонуклеотидних ланцюгів. Ці ланцюги характеризуються протилежною полярністю (відповідно 5`-3` та 3`-5`), що зумовлює напрям послідовного включення нуклеотидів до складу молекули в процесі її біохімічного синтезу. Утримання ланцюгів разом у формі т.з «дуплекса» як цілісної структури можливе завдяки хімічним зв’язкам між азотистими основами комплементарних нуклеотидів сусідніх ланцюгів. Сутність принципу комплементарності ґрунтується на здатності до утворення специфічних зв’язків виключно між аденіном та тиміном та між цитозином та гуаніном.

У просторовому плані молекула ДНК має форму подвійної спіралі, оскільки два її поліонуклеотидні ланцюги закручені один навколо одного та навколо спільної уявної осі. Просторова структура молекул ДНК в умовах фізіологічного оптимуму відзначається стабільністю і представлена т.з. В-формою. Зазначена форма ДНК формує правозакручену спіраль, на один оберт якої припадає ̴ 10,5 пар комплементарно зв’язаних нуклеотидів. Діаметр її молекули є майже постійним, а відстань між парами нуклеотидів, що знаходяться всередині цієї спіралі, становить 0,34 нм. Між площиною, в якій розміщуються комплементарні пари основ та перпендикуляром до осі спіралі, є незначний нахил, а кожна наступна пара нуклеотидів зміщена відносно попередньої приблизно на 35˚. У межах молекули ДНК окремі параметри її просторової моделі можуть дещо змінюватися залежно від того, які саме нуклеотиди та їх послідовності представлені на конкретній ділянці. Крім В-форми ДНК, у природі трапляються А-форма ДНК та Z-форма ДНК.

Розміри та молекулярна маса окремих молекул ДНК у межах клітини та у різних біологічних видів суттєво варіюють, але параметри конкретних молекул відзначаються досить високим рівнем стабільності як впродовж онтогенезу організму, так і в наступних його поколіннях.

Структура та функції РНК. Різноманіття РНК в організмах представлене трьома основними функціональними типами молекул:

‒ інформаційна або матрична ( і-РНК або м-РНК);

‒ транспортна (т-РНК);

‒ рибосомна (р-РНК).

Кожний з зазначених типів молекул РНК забезпечує виконання специфічних функцій, пов’язаних з процесами реалізації клітинами генетичної інформації.

Молекули м-РНК, будучи комплементарними одноланцюговими копіями окремих ділянок “змістовного” ланцюга ДНК, забезпечують передачу генетичної інформації від молекул ДНК на рибосоми, де вона використовується як інформаційна матриця в процесі синтезу рибосомами білків.

Транспортні РНК забезпечують процеси білкового синтезу в клітині шляхом постачання на рибосоми необхідних амінокислот, з яких будуються молекули поліпептидів, котрі є структурною основою всіх типів білків. Схему структурної будови молекул

т-РНК представлено на рис. 3.

Рис. 3.

У її складі вирішальну роль відіграє наявність антикодонової петлі та акцепторного закінчення, які безпосередньо забезпечують виконання молекулою покладених на неї функцій. Завдяки досить складній конфігурації цієї молекули, в її структурі розрізняють як одноланцюгові, так і подвійноланцюгові ділянки, причому останні здатні утворювати також і подвійну спіраль.

Молекули р-РНК становлять основний складовий матеріал, з якого побудовані рибосоми (органели клітин, на яких відбувається синтез білків). За своєю будовою це одноланцюгові молекули, але вони також можуть утворювати ділянки зі спареними основами за типом, подібним до описаного в молекулах т-РНК.

Генетична інформація на молекулах ДНК та м-РНК зашифрована в формі послідовності нуклеотидів т.з. змістовного або «плюс- ланцюга».

Молекули ДНК у клітинах організмів найімовірніше ніколи не перебувають у вільному чи т.з. «чистому» стані, а утворюють комплекси з білками та різноманітними низькомолекулярними катіонами- іонами металів, ди- та поліамінів, а також основними амінокислотними залишками білків. Електростатичні сили, що виникають на цій основі, зумовлюють конденсацію ДНК, унаслідок якої молекули ДНК формують складні нуклеопротеїнові комплекси, що мають назву хроматину. На різних етапах клітинного циклу хроматин та його основні складові ‒ молекули ДНК, зазнають структурних змін.

Молекули ДНК, утворюючи єдиний нуклеопротеїновий комплекс з супутніми їм білками-гістонами, спочатку формують нуклеосоми як елементарні структурні одиниці організації хроматину, а пізніше ‒ фібрили, які є основною формою хроматину під час інтерфази. Подальша їх «суперспіралізація» та компактизація хроматину на ранніх етапах мітозу або мейозу поступово приводить до формування особливих структурних утворів‒ хромосом. Кожна окремо взята хромосома є формою структурної організації відповідної молекули ДНК, що притаманна клітині на певних етапах клітинного циклу.

Основну частину маси хроматину становлять т.з. білки-гістони. У складі хроматину вони представлені п’ятьма різними типами (фракціями): Н1, Н2А, Н2В, Н3 і Н4. Вказані білки в комплексі з ділянками молекули ДНК здатні утворювати особливі структурні одиниці- нуклеосоми (рис.4). Крім білків-гістонів у складі хроматину присутні тимчасово або постійно і негістонові білки. Зокрема, це ферменти, які необхідні для забезпечення процесів реплікації ДНК та експресії генів.

Рис. 4.

Ген ‒ це одиниця спадкової інформації, що структурно є строго визначеною частиною молекул ДНК або м-РНК, у послідовності нуклеотидів яких міститься закодована інформація про певні функціональні продукти білкової природи, котрі забезпечують прояв відповідних ознак та властивостів організму, а також інформація, яка уможливлює синтез білкових продуктів. Гени за своєю суттю виступають дискретними носіями спадкової інформації організму і становлять окремі змістовні ділянки ДНК, у яких закодована первинна структура білків.

Генотип ‒ термін, під яким розуміють сукупність генів організму. Ділянки молекул ДНК, які відповідають окремим генам, можуть бути представлені як безперервними послідовностями нуклеотидів, так і окремими кодуючими фрагментами, що розділені між собою послідовностями нуклеотидів, які не містять такої інформації.

Геном ‒ це сукупність послідовностей ДНК у клітинах певного організму. У структурі геному еукаріот кодуючі послідовності (екзони) займають лише близько 1.5%. Решту послідовностей нуклеотидів припадає на міжгенну ДНК, яка охоплює регуляторні ділянки, багаточисельні повтори окремих фрагментів та беззмістовні ділянки (інтрони).

Сукупність морфологічних ознак хромосом клітини та їх кількість формує каріотип. Каріотип організму характеризують кількісними та якісними показниками, тобто числом хромосом і їх морфологічними особливостями ‒ розміром, формою, місцем локалізації первинної перетяжки (центромери) та вторинних перетяжок, характером забарвлення окремих фрагментів хромосом, наявністю або ж відсутністю т.з. «супутників» і т.ін.

Кожному біологічному виду притаманний властивий тільки йому каріотип. Хромосомний набір різних біологічних видів як правило варіює в значних межах, але в окремих випадках він може характеризуватися і однаковою кількістю хромосом (табл. ).

Таблиця

Хромосомні набори деяких лісотвірних порід

Порода	Диплоїдні форми (2n)	Поліплоїдні Форми
Сосна звичайна	24
Дуб звичайний	24
Модрина європейська	24
Ялина звичайна	24
Ялиця біла	24
Ясен звичайний	22
Осика тремтяча	38	57
Вільха чорна	22
Верба біла	76

Для хаpактеpистики хpомосомного набоpу виду застосовують також ідіогpаму ‒ детальне зобpаження каpіотипу на pисунку або фотогpафії.

Гени, які локалізовані в однакових локусах (ділянках) гомологічних хpомосом і контролюють в оpганізмі одні і ті ж самі ознаки, називають алельними; гени, які контролюють різні ознаки і розміщені в різних локусах- неалельними. Багато простих ознак організмів контролюються однією парою алельних генів. При цьому, якщо організм виник на основі статевого способу розмноження, то один з пари алельних генів має материнське походження, а інший ‒ батьківське. Під час мейотичного поділу клітини з утворенням гамет алельні гени завжди потрапляють в різні клітини. Нові пари алельних генів формуються внаслідок процесу запліднення. Першим, хто зумів експериментально довести, що гени локалізовані в хромосомах, був Томас Гент Морган з колегами, які є авторами хромосомної теорії спадковості організмів.

Кожна з гомологічних хромосом вміщує гени, які контролюють одні і ті ж ознаки організму. Якщо при цьому гени в гомологічних хромосомах знаходяться в однаковому алельному стані, то такий організм за цими генами є гомозиготним; якщо гени знаходяться в різних алельних станах ‒ гетерозиготним.

Завдання для самостійної роботи

1. Зобразіть структурну будову нуклеотидів та схему утворення зв’язків між ними.

2. Нарисуйте структурні моделі молекул ДНК та т-РНК та наведіть їх основні характеристики.

3. Перевірте знання основних положень та термінології теми.

4. Охарактеризуйте поняття «каріотип» та «ідіограма».

Контрольні питання

1. Назвіть основні риси структурної моделі ДНК Уотсона-Кріка.

2. Які функції виконують молекули ДНК?

3. Види та функції молекул РНК. Яка їх будова?

4. Яка структурна організація нуклеотидів? Які нуклеотиди відносяться до групи пуринів, а які до пірамідинів? Яке це має значення?

5. У чому полягає сутність принципу комплементарності?

6. Який зв’язок існує між хромосомами та ДНК? Які типи хромосом Ви знаєте?

7. Які показники та параметри можна застосувати, характеризуючи генетичний матеріал?

8. Як Ви розумієте терміни “дигетерозигота” та “дигомозигота”? Наведіть приклади гетерозиготних та гомозиготних домінантних (рецесивних) генотипів.

9. Чи можна використовувати каріотип та ідіограму як систематичні ознаки виду? Обгрунтуйте відповідь.

10. За якими морфологічними ознаками характеризують хромосоми?

11. У чому полягають особливості хромосомного набору диплоїдних організмів.

12. Чи впливає величина хромосомного набору в плані кількості хромосом на систематичне розміщення виду?

13. У чому полягає специфіка каріотипів близьких в систематичному відношенні видів?

Практичне заняття № 2

ДОСЛІДЖЕННЯ РОЛІ ОРГАНЕЛ КЛІТИНИ В ЗБЕРЕЖЕННІ, РЕАЛІЗАЦІЇ ТА ПЕРЕДАЧІ СПАДКОВОЇ ІНФОРМАЦІЇ

Мета: засвоїти генетичні аспекти клітинної оpганізації живого на пpикладі вищих pослин; ознайомитися з pоллю окpемих оpганел клітини в збеpеженні генетичної інфоpмації оpганізму, фоpмами та шляхами її pеалізації і способами пеpедачі потомству; засвоїти основні терміни та поняття.

Клітина — це найменша одиниця життя, здатна до самовідтвоpення, самооновлення та саморегуляції. Усім клітинам багатоклітинних оpганізмів, незалежно від місця їх локалізації в оpганізмі, належності до тих чи інших тканин та функціональної спеціаліза­­­ції, властиві загальні закономіpності стpуктуpної оpганізації.

У будові умовної типової клітини виокремлюють такі складові частини (рис.1):

Рис.1. Будова рослинної клітини

1). клітинна мембpана, яка, оточуючи клітину, відділяє її від зовнішнього сеpедовища, беpе участь в утвоpенні в межах клітини певних відділів (компаpтментів) і слугує стpуктуpним елементом всіх оpганел клітини;

2). цитоплазма, в якій містяться вода, pізноманітні солі та оpга­­­нічні pечовини, а також і оpганели клітини;

3). ядpо клітини.

Генетична інформація організму закодована у формі послідовності нуклеотидів молекул ДНК. Реалізація клітиною цієї інформації здійснюється шляхом синтезу білків, різноманіття та структура яких визначаються інформаційним потенціалом ДНК. Магістральний шлях передачі генетичної інформації від молекул ДНК до білків відображає сформульована в 1958р. Ф.Кріком як постулат т.з. «центральна догма молекулярної біології». ЇЇ зміст, з урахуванням сучасних уточнень, зводиться до такого: «потік інформації в живих організмах може відбуватися між нуклеїновими кислотами та від нуклеїнових кислот до білків, але не може проходити від білків до нуклеїнових кислот».

Матеріальними носіями спадковості клітини крім генів ядра є також і гени мітохондрій та хлоропластів, а також плазмід. На основі особливостей розподілу генетичного матеріалу в межах структур клітини розрізняють ядровий та позаядровий (синоніми- «цитоплазматичний» або «материнський») типи спадковості.

У процесах реалізації та передачі генетичної інформації вирішальна роль належить ядровому типу спадковості, оскільки генетична інфоpмація організму локалізована переважно в ядpах клітин, у формі ядрової ДНК. Геноми мітохондрій та хлоропластів за своєю організацією подібні до геномів прокаріотичних організмів. Їх генетичний апарат забезпечує здебільшого потреби функціонування та відтворення самих органел. Основною структурною формою мітохондріальних ДНК є лінійна; у окремих мітохондріальних геномах частково представлені також ДНК кільцевої форми.

Геном хлоропластів представлений переважно кільцевими дволанцюговими молекулами ДНК. Характерною особливістю хлоропласних геномів є їх подібність за будовою окремих генів та кодованих ними білків до геному бактерій. За функціональною спеціалізацією геном хлоропластів забезпечує здебільшого метаболічні процеси фотосинтезу, а також внутрішньоорганелний транскрипційний та трансляційний апарати.

Особливістю організації генома еукаріот є наявність в ядровому геномі ділянок, які за своєю структурою практично ідентичні геному позаядерних органел. Це стосується як мітохондрій, так і хлоропластів. У структурі мітохондріального геному вирізняються елементи геному хлоропластів. На сьогодні доведено можливість міжгенного обміну за участю ядра, хлоропластів та мітохондрій з утворенням гібридної ДНК, але в механізмах переміщення та інтеграції ДНК залишається багато питань для подальших досліджень.

Реалізація генетичної інформації шляхом утворення клітиною білкових продуктів, котрі забезпечують комплекс ознак та властивостей організму, здійснюється за рахунок функціонування в системі клітини особливих органел- рибосом. Будучи невеликими за розмірами але чисельними за кількістю, ‒ вони своєю діяльністю в клітинах забезпечують утворення всіх необхідних організмові білкових речовин. Останні ж, як відомо, здатні виконувати в організмі всі необхідні функції: структурну, енергетичну, транспортну, каталітичну, захисну та ін.

Загальну схему реалізації клітиною генетичної інформації наведено на рис.2.

Рис.2. Загальна схема реалізації клітиною генетичної інформації.

Першим етапом реалізації клітиною генетичної інформації є процес транскрипції. Під транскрипцією розуміють перенос генетичної інформації з дволанцюгової молекули ДНК на одноланцюгову молекулу м-РНК. Утворена внаслідок транскрипції молекула м-РНК є продуктом матричної біохімічної реакції, для проходження якої за матрицю слугує певна ділянка одного з ланцюгів ДНК. Деталі цього процесу буде розглянуто в наступних темах. Молекула м-РНК, на відміну від молекул ДНК, маючи значно менші розміри, здатна вийти за межі ядра (через отвори в ядерній мембрані). Внаслідок утворення зв’язу між м-РНК та рибосомою, останні вступають в процес трансляції. Взаємодіючи з рибосомами та т-РНК, м-РНК слугує інформаційною матрицею для забезпечення функціонування трансляційних комплексів клітини.

Трансляція — це процес декодування рибосомою інформації, яка міститься на молекулі м-РНК, з утворенням поліпептидного ланцюга.

Решта органел клітини безпосередньої участі в процесах збереження та реалізації генетичної інформації не беруть, але вони є важливими складовими частинами єдиної цілісної системи функціонування клітини. Генетичний апарат клітини, відіграючи основну роль в цій системі, залишається лише її складовою частиною.

Передача клітиною спадкової інформації потомству відбувається унаслідок як статевого, так і вегетативного розмноження. В основу цих процесів покладено, відповідно, мейотичний та мітотичний типи поділу клітин. Дочірнім клітинам, які утворюються в процесі ростових процесів організму, генетична інформація передається завдяки особливостям проходження материнськими клітинами т.з. мітотичного клітинного циклу, в ході якого молекули ДНК подвоюються.