Методы микробиологической диагностики чумы.

А. Бактериологический

Материал: от больных - пунктат из бубона, мокрота, кровь из вены;

от трупов - кусочки органов, лимфоузлы, кровь, костный мозг.

Рисунок 4.

Б. Биологический

Рисунок 5.

В. Аллергический (для ретроспективной диагностики)

Проба с пестином.

Г. Применение иммунологических реакций для обнаружения антигенов возбудителя (РПГА и ее модификации, ИФМ, РИМ).

Методы микробиологической диагностики туляремии.

А. Бактериологический и биологический

Материал: пунктат из бубона, гной из конъюнктивы, пленка из зева

Рисунок 6.

Б. Серологический.

Реакция агглютинации по типу реакции Райта (с 10-12 дня заболевания)

В. Аллергический.

Аллергическая проба с тулярином – накожная и внутрикожная (с 5-7 дня заболевания).

Методы микробиологической диагностики сибирской язвы.

А. Бактериологический.

Материал: тканевой выпот из-под струпа и со дна язвы, кровь, мокрота, испражнения.

Рисунок 7.

Б. Биологический.

Исследуемый материал (см. метод А)

В. Реакция термопреципитации Асколи.

Г. Аллергический.

Проба с антраксином.

Как осуществляется серологическая диагностика туляремии?

Какие препараты используются для аллергической диагностики ту­ляремии? Как ставятся и оцениваются аллергические реакции?

На какой день заболевания рекомендуется ставить реакцию агглю­тинации и аллергическую пробу при туляремии?

Каковы морфология, культуральные свойства и устойчивость во внешней среде возбудителя сибирской язвы? Как дифференцируется си­биреязвенная палочка от антракоидов и псевдосибиреязвенных бакте­рий?

Какой материал берется для исследования при сибирской язве?

Какие микробиологические методы используются для диагностики сибирской язвы?

Как осуществляется проверка животного сырья на зараженность си­биреязвенными палочками?

Каковы общие правила взятия, пересылки материала и лаборатор­ного режима при особо опасных инфекциях? В чем заключаются особен­ности работы с больными чумой и зараженными животными?

Какой иммунопрепарат используется для специфической терапии си­бирской язвы и как он применяется?

Какие вакцины используются для профилактики чумы, туляремии и сибирской язвы и как они применяется?

Какое заболевание у людей вызывает возбудитель псевдотуберкулеза?

Приложение к занятию 4

А. Иерсинии - возбудители псевдотуберкулеза (Yersinia pseudotuberculosis) и кишечного иерсиниоза (Y.enterocolitica)

Эти два вида иерсиний играют значительную роль в патологии че­ловека. Бактерии представляют собой полиморфные, не образующие спор грамотрицательные палочки, имеющие часто овоидную форму. Клетки в старых культурах окрашиваются неравномерно. Бактерии псевдотуберкулеза, взятые с влажного агара, могут иметь биполярную окраску, об­разуют капсулу, но с различной степенью выраженности. Оба вида бак­терий обладают подвижностью, обусловленной наличием перитрихиальных жгутиков. Подвижность выявляется посевом в столбик полужидкого агара уколом, но только при 18-20º , при 37° подвижность отсутствует.

Иерсинии неприхотливы к питательным средам, хорошо растут на обычных универсальных средах, способны активно размножаться в почве и воде. Оптимальная для роста температуре 30º С, верхняя и нижняя границы роста составляют 43° С и 0-2° С соответственно, оптимум рН 6,6-7,8. На среде Эндо колонии имеют диаметр 0,1-0,2 мм, круглые вы­пуклые, блестящие с ровными краями, бесцветные (не ферментируют лак­тозы). Колонии возбудителя псевдотуберкулеза, находящиеся в R-форме, почти не отличаются от колонии возбудителя чумы (пигментированный центр и фестончатый "кружевной" край). Биохимические различия трех видов иерсиний представлены в таблице.

Все три вида иерсиний отличаются и по своим антигенным свой­ствам.

Возбудитель псевдотуберкулеза по 0-антигенам разделяется на восемь групп (1-8) с 20 0-факторными антигенами (1-20). По 0-и Н-антигенам (а-е) этот вид подразделяют на 13 сероваров и подсероваров (la, 1в, 2а, 2в, 2с, 3, 4а, 4в, 5а, 5в, 6, 7, 8).

Иерсиния энтероколитика характеризуется антигенной неоднород­ностью по 0-антигену. В настоящее время различают более 30 сероваров этого вида. Большинство из них адаптированы к некоторым видам животных или широко распространены во внешней среде. Подавляющее большинство штаммов, выделенных от человека, принадлежат к сероварам 03 и 09, реже встречаются серовары 08, 05в и очень редко - серовары 01, 02, 06, 07, 010, 011, 013, 014, 015, 016, 017.

От людей, больных псевдотуберкулезом, чаще всего выделяются штаммы, относящиеся к Серовару 1, реже 3 и 4.

В ходе эволюции у иерсиний закрепилась необходимость существо­вания в двух средах обитания - внешней (сапрофитическая фаза жизни) и в организме теплокровных животных и человека (паразитическая фаза). Для осуществления паразитической стадии иерсинии должны проникнуть в организм теплокровного животного. Заражение возбудителем псевдо­туберкулеза чаще всего происходит при употреблении в пищу инфициро­ванных иерсиниями продуктов, хранившихся при пониженной температу­ре (4-12ºС) в холодильниках и овощехранилищах. В этих условиях бак­терии в силу своей психрофильности могут размножаться и накаплива­ться в пищевых субстратах.

Иерсинии при пониженной температуре обладают высоким потенциа­лом клеточной и тканевой инвазивности и способны сохранять высокий уровень вирулентности, однако возбудитель может проникнуть в орга­низм человека и через любые слизистые оболочки, вероятно, за счет неспецифических механизмов.

Основным источником иерсиниозов являются дикие и синантропные грызуны, домашние и сельскохозяйственные животные. Возможно зара­жение человека от человека. Штаммы Y.pseudo-tuberculosis выделены от 175 видов млекопитающих, 124 видов птиц, 7 видов рыб. Зараженные грызуны, животные и люди выделяют возбудителя с испражнениями и мо­чой, загрязняя воду, растения и другие объекты внешней среды. Таким образом, пищевой путь в передаче возбудителей псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза является ведущим. Заражение происходит в ре­зультате употребления в пищу сырых или недостаточно термически обра­ботанных продуктов (мяса, мясных продуктов, молока, овощей, фруктов, зелени). Оба вида возбудителя способны существовать внутри растений (салата, гороха, овса и т.п.).

Заболевания, вызываемые иерсиниями, характеризуются полиморфностью клинических проявлений, поражением желудочно-кишечного тракта, тенденцией к генерализации, септикопиемии и поражению различных ор­ганов и систем.

Патогенные свойства иерсиний обоих видов, как и возбудителя чу­мы, во многом определяются наличием у них плазмид с молекулярной массой 42-48 МД и 82 МД. Плазмиды контролируют такие свойства возбу­дителей, как зависимость роста от наличия в среде кальция, способ­ность синтезировать антигены вирулентности (v-w), пили адгезии, спо­собность вызывать керато-конъюнктивит у морской свинки и т.п.

Микробиологическая диагностика иерсиниозов включает использо­вание бактериологического метода и серологических реакций.

При бактериологическом методе исследуемый материал от больных (испражнения, кровь, слизь из зева), а также подозрительные продук­ты или воду засевают на среды Эндо, Плоскирева, Серова (индикатор­ную и дифференциальную) и инкубируют при 37° в течение 48-72 часов.

Подозрительные колонии (мелкие бесцветные на средах Эндо и Плоскирева и окрашенные колонии двух различных форм на средах Серова) пересевают для получения чистых культур, которые идентифицируют по биохимическим признакам и окончательно типируют с помощью диагности­ческих агглютинирующих сывороток.

Для серологической диагностики псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза используют развернутую реакцию агглютинации (по типу реакции Видаля) с соответствующими диагностикумами или реакцию пас­сивной гемагглютинации (РПГА) с антигенным эритроцитарным диагностикумом. Положительными считают реакции при титре антител 1:400 и вы­ше. Реакции рекомендуется ставить с парными сыворотками (с интерва­лом в несколько дней). Нарастание титра антител будет свидетельство­вать о специфичности инфекционного процесса.

Б. Классификация вида Yersinia pestis (Саратов, 1985)

Y. pestis subsp. pestis - основной подвид

Y. pestis subsp. altaica - алтайский подвид

Y. pestis subsp. caucasica - кавказский подвид

Y. pestis subsp. hissarica - гиссарский подвид

Y. pestis subsp. ulegeica - улэгейский подвид

В. Особенности генетического контроля факторов

патогенности у возбудителя чумы.

Контроль наиболее важных факторов патогенности возбудителя чу­мы осуществляется плазмидами, на которых локализованы гены вирулентности. Известны три класса плазмид, контролирующих различные факто­ры патогенности возбудителя: рУР (м.м.6 МД); рУТ (м.м. 60 МД) и рУV (м.м. 47 МД).

Плазмида рУР (6 МД) несет гены, определяющие синтез пестицина. фибринолизина и плазмокоагулазы.

Плазмида рУТ (60 МД) несет детерминанты, контролирующие синтез антигена фракции I и "мышиного" токсина.

Плазмида рУV (47 МД) ответственна за синтез антигенов v и w и термоиндуцибельных белков внешней мембраны, а также зависимость роста чумной палочки от наличия в среде ионов Са++.

Г. Основные различия между возбудителями чумы,

псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза.

Признак	Вид возбудителя
	Возбудитель чумы	Возбудитель псевдотуберкулеза	Возбудитель кишечного иерсиниоза
Подвижность	-	+	+
Лизис а) индикаторным чумным фагом	+	-	-
б) псевдотуберкулезным фагом	-	+	-
Рост на голодно-кислой среде	-	+	+
Ферментация: рамнозы	-	+	-
маннита	+	+	+
мальтозы	+	+	+
сахарозы	-	-	+
Наличие: уреазы	-	+	+
аденозиндезаминазы	-	+
плазмокоагулазы	+	-	-
фибринолизина	+	-	-
Фракции 1	+	-	-
Вирулентность: в S-форме	-	+	+
в R-форме	+	-	-

Д. Основные дифференциальные признаки

Bacillus anthracis и Bacillus anthraсоides

Вид микроорганизма	Подвижность	Капсуло- образование	Гемолиз	Патогенность для морских свинок и кроликов
Bacillus anthracis	-	+	-	+
Bacillus anthraсоides	-(- +)	-	+	-

Е. Факторы патогенности и генетический

контроль их синтеза у возбудителя

сибирской язвы

Основными факторами патогенности сибиреязвенной палочки, которые определяют патогенез заболевания,являются сложнокомпонентный токсин и капсула. .

Синтез сложного токсина контролируется плазмидой pXOI, имеющей молекулярную массу 110-114 МД. В составе плазмиды pXOI имеется три гена, определяющих синтез основных компонентов экзотоксина:

ген cya-ОФ, определяет синтез фактора отечности

ген pag-ПА, определяет синтез протективного антигена

ген lef-ЛФ, определяет синтез летального фактора

Продуктом гена суа-ОФ является аденилатциклаза, катализирующая накопление в клетках эукариотов цАМФ.

Синтез капсулы сибиреязвенной палочкой контролируется плазмидой рХO2, имеющей м.м. 60 МД.

Ж. Географические разновидности туляремийных бактерий.

Расы	Ферментация глицерина	Наличие цитруллин-уреидазы	Патогенность для домашних кроликов и людей
Голарктическая раса (Европа, Азия) Francisella tularensis holarctica	-	-	умеренно патогенна
а) японский вариант - var. japonica	+	-	“
Среднеазиатская раса - Francisella tularensis mediasica	+	+	“
Неарктическая, или американская, раса - Francisella tularensis nearctica	+	+	Относительно высокая патогенность для кроликов и людей

З. Ландшафтные типы природных очагов туляремии.

Пойменно-болотный, луго-полевой, степной, лесной, предгорно-ручьевой, тугайный (пойменно-пустынный) и тундровый.

ЗАНЯТИЕ 5.

Дата_________

Тема: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ ДИАГНОЗ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ

(брюшной тиф и паратифы)

План занятия

1. Изучение морфологических и биохимических свойств бактерий тифо-паратифозной группы.

2. Бактериологическое исследование крови брюшнотифозного больного. Посев крови на среду с желчью (разбор с демонстрацией).

3. Реакция Видаля. Постановка реакции агглютинации с 0- и Н-диагностикумами.

4. Бактериологическое исследование испражнений брюшнотифозного больного: посев на среду обогащения и дифференциально-диагностические среды.

5. Разбор методов диагностики брюшнотифозного бактерионосительства.

Методические указания.

§ 1. Приготовить препараты-мазки из культур бактерий - возбудителей брюшного тифа, паратифа А, паратифа В и кишечной палочки, окрасить по Граму и промикроскопировать. Сравнить морфологию бактерий во всех препаратах и отметить морфологическое сходство их друг с другом.

Препараты зарисовать.

.Изучить и записать в тетрадь биохимические свойства бактерий тифо-паратифозной группы по готовым демонстрационным наборам посевов на среды "пестрого ряда".

§ 2. Взятая из вены больного кровь в количестве 8-10 мл для выделения гемокультуры засевается в среду с желчью (МПБ + 10 процентов желчи + 1 процент глюкозы + индикатор Андреде).

Посев крови производят непосредственно у постели больного в десятикратный (по отношению к количеству крови) объем питательной среды. Посев помещают в термостат при 37°, а на следующие сутки производят высев на скошенный агар и на дифференциально-диагностические среды (Левина, Плоскирева, висмут-сульфит-агар, Эндо).

§ 3. Реакцию Видаля ставят с 0-Н-диагностикумами для обнаружения О- и Н-антител в крови больного брюшным тифом. Для этого необходимо взять два ряда пробирок по 6 шт. и в каждом из них приготовить последовательно разведения сыворотки больного в физиологическом растворе по следующей схеме:

Номера пробирок	1	2	3	4	5	6
Разведения сыворотки	1:50	1:100	1:200	1:400	1:800	контроль антигена
Физиологический раствор	0	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Сыворотка больного в разведении 1:25	0,5	0,5
Диагностикум O (H)	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5

Во второй пробирке сыворотку смешать с физиологическим раствором и 0,5 мл перенести в третью, снова перемешать и 0,5 мл смеси перенести из третьей пробирки в четвертую, а из четвертой - таким же способом в пятую. После перемешивания из пятой пробирки 0,5 мл смеси удалить в банку с раствором хлорамина.

В пробирки первого ряда добивать по 0,5 мл брюшнотифозного 0-диагностикума, а в пробирки второго ряда - по 0,5 мл брюшнотифозного Н-диагностикума. Предварительные результаты реакции учесть после 2-часового инкубирования пробирок в термостате при 37º, а окончательные - на следующем занятии, после суточного выдерживания при комнатной температуре.

§ 4. Испражнения брюшнотифозного больного засеять на одну из сред обогащения (среда магниевая, среда с селенитом) и одновременно на дифференциально-диагностические среды: Эндо, Плоскирева, Левина или висмут-сульфит-агар. Через 8-10 часов инкубирования в термостате со среды обогащения также производится посев на плотную дифференциально-диагностическую среду.

Рисунок 1. Возбудитель брюшного тифа. Salmonella typhi.

Рисунок 2. Возбудитель паратифа А. S. paratyphi А.

Рисунок 3. Возбудитель паратифа В. S. paratyphi B.

Рисунок 4. Кишечная палочка. Eschrichia coli.

Бихимческие свойства бактерий тифо-паратифозной

группы.

Вид микроба	Лак- тоза	Глю- коза	Ман-нит	Саха-роза	Моло-ко	Индол	Серо-водород	Подвиж-ность
S. typhi
S. paratyphi А
S. paratyphi B
Eschrichia coli

Методы микробиологической диагностики брюшного тифа и

паратифов.

А. Бактериологический.

1. Исследование крови больного.

Рисунок 5.

Контрольные вопросы.

Чем отличаются сальмонеллы брюшного тифа от сальмонелл паратифов А и В по биохимическим свойствам?

Какова антигенная структура сальмонелл?

Какие микробиологические методы используются для диагностики брюшного тифа и паратифов?

Какой материал берется от больного для ранней диагностики брюшного тифа и как этот материал исследуется?

Почему при серологической диагностике брюшного тифа используются "О" и "Н" - антигены?

Какое значение имеет исследование испражнений при брюшном тифе и паратифах?

Каков порядок исследования испражнений?

2. Исследование испражнений, желчи, мочи.

Рисунок 6.

Б. Серологический.

РПГА с эритроцитарным Vi-диагностикумом. ИФМ. Реакция Видаля.

Методы микробиологической диагностики брюшнотифозного бактерионосительства

А. Бактериологический.

Исследование желчи, испражнений, мочи.

Б. Серологический.

Реакция Ви-гемагглютинации для выявления Ви-антител, определение 0-, Н-, Vi-антител одновременно.

В. Аллергический.

Кожная проба с Ви-тифином.

Как производится идентификация выделенных чистых культур возбудителей брюшного тифа?

Как определяются серологическая группа и серотип сальмонелл?

Как осуществляется фаготипирование брюшнотифозных бактерий и в чем заключается значение этого метода?

Какой материал берется для бактериологического исследования на брюшнотифозное бактерионосительство и каким образом он исследуется?

Как осуществляется серологическая диагностика брюшнотифозного бактерионосительства?

Каковы особенности патогенеза брюшного тифа?

Какие существуют иммунопрепараты для профилактики брюшного тифа и паратифов?

Приложение к занятию 5.

А. Классификация Семейства Enterobacteriaceae

Род Еscherichia Род Arizona

Gitrobacter Proteus

Enterobacter Providencia

Hafnia Morganella

Klebsiella Becbobacterium

Salmonella Xenornabdus

Erwinia Kluyvera

Serratia Balmella

Edwardsiella Gedecia

Shigella Tatumella

Yersinia Obesumbacterium.

Б. Для фаготипирования брюшнотифозных бактерий, содержащих Vi-антиген, выпускается набор типовых брюшнотифозных Vi -фагов в ампулах с указанием рабочих разведений.Vi-I-фаг - универсальный, лизирует все культуры бактерий, содержащие Vi-антиген, Vi-II- фаг - лизирует только те штаммы, на которых он пассировался. Этот фаг подразделен на типы, обозначаемые заглавными буквами латинского алфавита. Соответственно типовым фагам существуют фаготипы брюшнотифозных бактерий, которые имеют идентичные обозначения.

В природе циркулирует 106 фаготипов возбудителя брюшного тифа. На территории нашей страны чаще всего встречаются фаготипы A, F 2, EI, С, Е2.

Разработаны системы фаготипирования возбудителей паратифа В (37 фаготипов) и паратифа А (более 10 фаготипов).

ЗАНЯТИЕ 6.

Дата_________

Тема: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ ДИАГНОЗ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ

(продолжение).

План занятия.

А. Микробиологическая диагностика брюшного тифа и паратифов.

1. Продолжение исследования крови брюшнотифозного больного: посев со среды Рапопорт на скошенный МПА и дифференциально-диагностические среды - Плоскирева, Левина, Эндо, висмут-сульфит-агар (демонстрация).

2. Регистрация результатов реакции Видаля, поставленной на предыдущем занятии.

3. Продолжение исследования испражнений брюшнотифозного больного: изучение выросших колоний, пересев бактерии из подозрительных колоний на среды "пестрого ряда" и на скошенный МПА.

4. Применение иммунофлуоресцентного метода для ускоренного обнаружения и идентификации возбудителей брюшного тифа (демонстрация).

Б. Микробиологическая диагностика пищевых токсикоинфекций.

1. Изучение морфологических, культуральных и биохимических свойств сальмонелл.

2. Исследование пищевых продуктов на наличие возбудителей пищевыхтоксикоинфекций: посев на среды обогащения и дифференциально-диагностические среды.

3. Исследование пищевых продуктов на наличие патогенных стафилококков и условно патогенных микробов (кишечная палочка, протей). Разбор методов.

Методические указания.

А. Микробиологическая диагностика брюшного тифа и паратифов.

§ 1. Отметить изменения, наступившие в среде Рапопорт в результате роста возбудителей брюшного тифа (покраснение среды) и паратифов (покраснение среды и наличие газа), и зарегистрировать (занятие 7). Сделать пересев культуры бактерий со среды Рапопорт на скошенный МПА и среды Плоскирева, Эндо, Левина (демонстрация).

§ 2. Произвести учет результатов реакции Видаля по четырехкрестной системе с "О"- и "Н"-диагностикумами. Результаты реакции и заключение записать в тетрадь.

§ 3. На чашках с посевами найти бесцветные прозрачные колонки, типичные для возбудителей тифо-паратифозной группы. Половину колонии использовать для приготовления препарата-мазка (окрасить по Граму), оставшуюся часть колонки засеять на среды "пестрого ряда", среду Пешкова (для исследования подвижности) и на скошенный МПА.

Б. Микробиологическая диагностика пищевых токсикоинфекций.

§ 1. Приготовить препараты-мазки из культур сальмонелл и кишечной палочки, окрасить по Граму, промикроскопировать и сравнить морфологию бактерий во всех препаратах. Препараты зарисовать. Изучить рост на жидких и плотных средах и биохимические свойства сальмонелл по готовым демонстрационным наборам сред "пестрого ряда".

§ 2. Приготовить взвесь в физиологическом растворе кусочка пищевого продукта, зараженного сальмонеллами, и произвести посев взвеси на среду обогащения и на дифференциально-диагностическую среду Плоскирева или Эндо.

Результаты реакции Видаля.

Разведение сыворотки	1:50	1:100	1:200	1:400	1:800	контроль
“O”-диагностикум
“H”-диагностикум

Заключение_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Методы микробиологической диагностики пищевых токсикоинфекций, вызываемых сальмонеллами и условно патогенными бактериями кишечной группы.

А. Бактериологический.

Рисунок 1.

Б. Иммунологические.

Применение реакции иммунофлуоресценции как экспресс-метода для обнаружения сальмонелл.

Реакция агглютинации для выявления антител с парными сыворотками больного по типу реакции Видаля. Для реакции используют диагностикум, живые лабораторные культуры и аутоштаммы.

Применение реакции пассивной гемагглютинации с использованием О-эритроцитарного диагностикума для обнаружения антител и реакции Кумбса для обнаружения неполных антител.

Рисунок 2. Микроскопия колонии из посева испражнений, сделанного на прошлом занятии. Окраска по Граму.

Рисунок 3. Escherichia coli.

Рисунок 4. Salmonella enteritidis.

Рисунок 5. S. typhimurium.

Рисунок 6. S. choleraesuis. Морфология сальмонелл и кишечной палочки. Окраска по Граму.

Методы микробиологической диагностики пищевых отравлений, вызываемых стафилококками.

А. Бактериологический.

Материал: остатки пищи, рвотные массы, промывные воды, испражнения, смывы с предметов.

Рисунок 7.

Б. Обнаружение стафилококковых энтеротоксинов: непрямой бактериологический, серологический и биологический методы.

В. Энтеротоксин на кошках определяют внутривенным введением материала. Полученный центрифугат или фильтрат стафилококковой культуры прогревают в кипящей водяной бане в течение 30 минут и вводят кошкам в вену уха или бедренную вену в количестве 0,5 мл на 1 кг веса. Наличие рвоты и поноса или только рвоты, наступившей в сроки от 30 минут до 3 часов, указывает на присутствие энтеротоксина.

Контрольные вопросы:

В чем суть иммунофлуоресцентного метода диагностики брюшного тифа?

Какие микроорганизмы чаще всего вызывают пищевые токсикоинфекции?

Какие условия способствуют возникновению пищевых токсикоинфекций?

Какие сальмонеллы чаще всего оказываются возбудителями пищевых токсикоинфекций?

Каковы морфологические,тинкториальные, культуральные и биохимические свойства сальмонелл - возбудителей пищевых токсикоинфекций?

Каковы особенности патогенеза пищевых токсикоинфекций?

Какие микробиологические методы используются для диагностики пищевых токсикоинфекций?

Что подлежит исследованию при пищевых токсикоинфекциях?

На какие питательные среды следует сеять материал при пищевых токсикоинфекциях?

Как производится идентификация сальмонелл - возбудителей пищевых токсикоинфекций?

Как производится исследование пищевых продуктов на наличие условно патогенных микробов кишечной группы?

Как производится исследование пищевых продуктов на наличие стафилококка?

Как обнаруживается стафилококковый энтеротоксин?

Какие формы сальмонеллезов бывают у животных?

Каковы эпидемиологические особенности пищевых токсикоинфекций?

Каковы меры предупреждения пищевых токсикоинфекций?

Что такое спорадический сальмонеллез и каковы особенности его эпидемиологии?

Приложение к занятию 6.

Классификация пищевых отравлений.

Пищевые отравления
Небактериального происхождения	Микробного происхождения
	Интоксикация, или токсикозы		Токсикоинфекция
Возникают при употреблении продуктов, ядовитых по своей природе (грибы, ягоды, некоторые виды рыб), а также при попадании в организм ядовитых неорганических и органических веществ и ядохимикатов.	Бактериальной природы: отравление стафилококковым токсином. Возбудитель: Staphylococcus aureus	Грибковой природы, или микотоксикозы: например, алиментарно-токсическая алейкия. Возбудитель: Fusarium sporotrichiella	Возникают при попадании в организм живых бактерий, относящихся к следующим семействам: Enterobacteria-ceae Vibrionaceae Streptococcaceae Bacillaceae Pseudomonadaceae

ЗАНЯТИЕ 7.

Дата_______

Тема: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ ДИАГНОЗ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ

(продолжение).

План занятия.

A. Микробиологический диагноз брюшного тифа и паратифов (окончание).

1. Агглютинация выделенной гемокультуры.

2. Учет результатов посева на среды "пестрого ряда".

3. Агглютинация культуры, выделенной из испражнений больного.

Б. Микробиологический диагноз пищевых токсикоинфекций (продолжение).

1. Посев подозрительной колонии с дифференциально-диагностической среды на среда "пестрого ряда" и МПА для выделения чистой культуры и изучения ее биохимических свойств.

B. Микробиологический диагноз дизентерии.

1. Изучение морфологии и биохимических свойств дизентерийных бактерий.

2. Исследование испражнений больного дизентерией - посев на среду Плоскирева.

Методические указания.

A. Микробиологический диагноз брюшного тифа и паратифов (окончание).

§ 1. Поставить на стекле реакцию агглютинации выросшей на скошенном МПА культуры с монорецепторными адсорбированными 0- и Н-сыворотками, учтя предварительно ее биохимические свойства (среда Рапопорт). При отрицательной реакции агглютинации с 0-сывороткой необходимо поставить реакцию агглютинации с Ви-сывороткой. Результаты реакции зарегистрировать в тетради.

§ 2,3. Поставить реакцию агглютинации с монорецепторными 0- и Н-сыворотками, принимая во внимание биохимические свойства выделенной культуры. Результаты зарегистрировать в тетрадь.

Б. Микробиологический диагноз пищевых токсикоинфекций (продолжение).

§ 1. Произвести макро- и микроскопическое исследование подозрительных колоний (бесцветные, прозрачные). Посеять подозрительную колонию на скошенный МПА и среды "пестрого ряда".

B. Микробиологический диагноз дизентерии.

§ 1. Приготовить препараты-мазки из чистых культур дизентерийных бактерий, окрасить по Граму, промикроскопировать и зарисовать. Изучить биохимические свойства дизентерийных бактерий по демонстрационным наборам сред "пестрого ряда". Обратить внимание на рост дизентерийных бактерий и кишечной палочки на среде Ресселя.

Регистрация результата роста культуры на среде Рапопорт.

Агглютинация гемокультуры.

Рисунок 1. Реакция О–агглютинации.

Рисунок 2. Реакция Н-агглютинации.

Рисунок 3. Реакция Ви-агглютинации.

Регистрация результатов биохимической активности корпускулы.

Куль-тура	Глюко-за	Лакто-за	Ман-нит	Саха-роза	Индол	Моло-ко	Серово-дород	Среда Пешкова

Реакция агглютинации выделенной от больного культуры.

Рисунок 4.

Заключение. ____________________________________________________________

§ 2. Произвести посев испражнений больного дизентерией на чашки с дифференциально-диагностической средой Плоскирева. Бактериальной петлей каплю испражнений нанести на пластинку бактоагара Плоскирева и тщательно рассеять штриховым способом на половине чашки (1 чашка дается на двух студентов).

Контрольные вопросы.

Какие микроорганизмы являются возбудителями дизентерии?

Какие принципы используют для классификации возбудителей дизентерии?

Как отличаются различные виды дизентерийных бактерий по биохимическим свойствам?

Каковы особенности антигенного строения бактерий вида Зонне?

Каковы особенности антигенного строения бактерий вида флекснера?

По каким признакам бактерии вида флекснера подразделяются на серовары и подсеровары?

Каковы особенности антигенного строения бактерий вида Бойда?

Каковы особенности патогенеза дизентерии?

Какие микробиологические методы используются для диагностики дизентерии?

Какой материал исследуется для выделения возбудителей дизентерии и на какие питательные среды его засевают?

Где в организме больного локализуется возбудитель дизентерии?

Как следует брать материал от больного дизентерией?

Рисунок 5. Возбудитель пищевой токсикоинфекции со среды Плоскирева. Окраска по Граму.

Рисунок 6. Shigella sonnei. Окраска по Граму.

Рисунок 7. Shigella flexneri. Окраска по Граму.

Методы микробиологической диагностики дизентерии.

А. Бактериологический.

Рисунок 8.

Б. Аллергический.

Внутрикожная проба с дизентерином (проба Цуверкалова).

По каким признакам идентифицируют возбудителей дизентерии?

Каково различие между типовыми и групповыми диагностическими агглютинирующими дизентерийными сыворотками?

Для чего необходимо серологическое типирование возбудителей?

Какова методика кератоконьюктивальной пробы и каково ее значение?

Каковы методика и цель определения чувствительности дизентерийных бактерий к антибиотикам?

В каких случаях и как применяют дизентерийный бактериофаг?

В чем заключается сущность методов определения чувствительности бактерий Зонне к колицинам и типов колицинов, продуцируемых шигеллами?

Как ставится аллергическая проба Цуверкалова?

Чем обусловлена вирулентность дизентерийных бактерий?

Приложение к занятию 7.

А. Ферментативные типы шигелл Зоне.

Типы	Ферментация
	рамнозы	ксилозы
1	+	-
2	(+)	-
3	+	+
4	+	(+)

Обозначения: + ферментация в первые сутки,

(+) ферментация замедленная,

- отсутствие ферментации.

Б. Метод колициногенотипирования.

Метод колициногенотипирования разработан английскими исследователями Абботом и Шенноном (1958) и основан на определении колициногенотипов шигелл Зонне по действию этих бактерий на 15 индикаторных культур, из которых 13 принадлежит к виду шигелл Зонне, 1 - s. dysenteriae 2 (Штуцера-Шмитца) и 1 - Escherichia сoli К-12 ROW.

С помощью этого набора индикаторных культур в настоящее время выявлено 17 колициногенных типов бактерий Зонне.

Испытываемую культуру сеют на МПА с генцианвиолетом двумя линейными штрихами параллельно диаметру чашки. После инкубирования при 37° в течение 48 часов выросшую культуру убивают парами хлороформа и удаляют с поверхности среды узким краем стерильного шлифованного предметного стекла. На поверхность агара наносят свежие культуры индикаторных штаммов в виде линейных штрихов, пересекающих линии посева исследуемой культуры. Посевы индикаторных штаммов инкубируют 18-20 часов при 37° и производят учет результатов по наличию или отсутствию зон торможения роста индикаторных культур и их размерам.

Регистрируют результаты следующими условными обозначениями:

++++ - зона торможения 15-20 мм;

+++ - зона торможения 10-15 мм;

++ - зона торможения более 5 мм;

+ - зона торможения 4-5 мм;

± - зона торможения меньше 4 мм;

- - отсутствие зоны торможения.

Полученный спектр действия исследуемой культуры на индикаторные штаммы сопоставляют со стандартной схемой титрования и присваивают этой культуре соответствующий колициногенотип.

Классификация бактерий рода Shigella.

Подгруппа и ее характеристика	Вид и серовары	Подсеровары	Антигенная формула
			Типовой антиген	Групповые антигены
Подгруппа А. Не ферментирует маннита. Серологически каждый серовар отличается от других.	S. dysenterica 1
	2
	3
	4
	5
	6
	7
	8
	9
	10
	11
	12
Подгруппа В. Обычно ферментируют манит. Серологически серовары родственны друг другу.	S. flexneri 1	1а	1	2,4
		1в	1:S	6:2,4
	2	2а 2в	2	3,4
			2	7,8
	3	3а 3в 3с	3	6:7,8
			3	6:3,4
			3	6
	4	4а 4в	4	В:3,4
			4	В:6:3,4
	5		5	7,8
			5	(3,4)
	6	Некоторые штаммы ферментируют глюкозу и маннит с образованием кислоты и газа	6	2,4
	Вариант X		-	7,8
	Вариант Y		-	3,4
Подгруппа С. Обычно ферментируют манит. Серологически серовары отличаются друг от друга.	S. boydii Серовары 1-18
Подгруппа D. Обычно ферментируют манит, поздно лактозу и сахарозу.	S. sonnei Обычно вырастают колонии двух фаз – мелкие (имеют плазмиду), крупные, плоские (не имеют плазмиды)

Методика колицинотипирования при помощи колициногенных штаммов.

Определение спектра чувствительности культур Зонне к колицинам проводят при помощи эталонных колициногенных штаммов Фредерика:

Наименование штамма		Тип продуцируемого колицина
E. coli	Ca-18	B
E. coli	Ca-23	D
E. coli	Ca-38	E + I
E. coli	Ca-42	F
E. coli	Ca-46	G
E. coli	Ca-53	I
E. coli	Ca-62	J + I
E. coli	Ca-235	K
E. coli	Ca-7	V
E. freundii	Ca-31	A
S. boydii	p-1	S1
S. dispar	p-15	S4
S. dispar	p-14	S5
S. sonnei	p-9	S3 + 1

Схема определения колицингенотипов шигелл Зонне.

Рисунок 9.

Колицинотипирование, т.е. определение спектра чувствительности культур Зонне к колицинам, определяют следующим образом.

Свежие эталонные колициногенные штаммы Фредерика, выросшие на среде Ресселя, сеют уколом петли в соответствующие квадраты чашки с 1,5%-ным МПА, подкрашенным генцианвиолетом, и инкубируют при 37º в течение 24 часов. Выросшие колонии бактерии убивают парами хлороформа, и поверхность агара заливают 2,5 мл расплавленного 0,7%-ного МПА, содержащего 2 капли 6-часовой испытуемой бульонной культуры шигелл Зонне. После 20-часового роста при 37° производят учет результатов опыта. При наличии чувствительности к колицинам испытуемого штамма бактерии Зонне вокруг колоний колициногенных культур образуются зоны задержки роста подобно зонам задержки роста вокруг дисков с антибиотиками. Культура считается чувствительной к колицину, если ширина задержки роста бактерий более 2 мм. Результаты регистрируют плюсами: + - зона задержки 2 мм; ++ - зона задержки 2-5 мм, +++ - зона задержки 5-10 мм, ++++ - зона задержки более 10 мм.

В.

Вирулентность дизентерийных бактерий обусловлена наличием у них факторов адгезии и колонизации, инвазии. (Эти факторы патогенности контролируются главным образом плазмидами). Кроме того, шигеллы способны вырабатывать 2 типа экзотоксинов: цитотонины (термолабильный и термостабильный) и цитотоксины (способностью вырабатывать цитотоксины шигеллу наделяют конвертирующие умеренные фаги).

Патогенность шигелл определяется с помощью кератоконъюнктивальной пробы на морской свинке.

Типовые и индикаторные культуры набора Абботта и Шеннона для колициногенотипирования шигелл Зонне.

Типовые колициногенные культуры		Индикаторные культуры
Наименование штамма	Колициногенотип	Наименование штамма	Оригинальный № по схеме Абботта и Шеннона	Регистрационный № по списку Интернационального центра по шигеллам в Лондоне
S. sonnei	1A	S. sonnei	2	100031
S. sonnei	1B	S. sonnei	56	100032
S. sonnei	2	S. sonnei	17	100033
S. sonnei	3	S. sonnei	2M	100034
S. sonnei	3A	S. sonnei	38	100035
S. sonnei	4	S. sonnei	56/56	100036
S. sonnei	5	S. sonnei	56/98	100037
S. sonnei	6	S. sonnei	R 1	100038
S. sonnei	7	S. sonnei	R 6	100039
S. sonnei	8	S. dysenteriae 2	M 19	CTC8218
S. sonnei	9	S. sonnei	2/7	100040
S. sonnei	10	S. sonnei	2/64	100041
S. sonnei	11	S. sonnei	2/15	100042
S. sonnei	12	S. sonnei	R5	100043
S. sonnei	13	E. coli K-12	ROW	100044
S. sonnei	14
S. sonnei	15

Схема колициногенотипирования шигелл Зонне по Абботту и Шеннону.

	Индикаторные культуры
	2	56	17	2M	38	56/56	56/98	R 1	R 6	M 19	2/7	2/64	2/15	R5	ROW
1A	+	+	+	-	-	+	+	-	-	+	-	-	-	-	+
1B	+	+	+	-	-	+	+	-	+	+	-	-	-	-	+
2	-	+	+	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	+
3	+	+	+	-	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
3A	+	+	+	-	+	+	+	+	+	-	+	+	+	+	+
4	+	+	+	V	+	-	-	+	+	-	+	+	+	-	+
5	+	+	+	V	+	+	+	+	+	+	+	+	+	-	+
6	-	+	-	-	-	+	+	-	+	-	-	-	-	-	+
7	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
8	+	-	+	-	+	-	-	+	-	-	-	-	+	-	+
9	+	+	+	-	V	+	+	+	+	-	-	-	+	-	+
10	+	+	+	-	+	+	+	+	+	+	-	-	+	-	+
11	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+
12	+	+	-	-	+	+	+	+	+	-	-	-	+	-	+
13	-	+	+	-	-	+	+	-	+	-	-	-	-	-	+
14	+	+	+	V	+	+	+	+	+	-	+	+	+	-	+
15	+	-	+	+	+	-	-	+	-	-	+	+	+	+	+

Обозначения: + наличие зоны торможения индикаторных штаммов,

- отсутствие зоны торможения,

V – вариабельные результаты.

Занятие 8.

Дата________

Тема: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ ДИАГНОЗ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ

(продолжение).

План занятия.

А. Микробиологический диагноз пищевых токсикоинфекций (окончание).

1. Учет результатов посева на среды "пестрого ряда" и микроскопия выделенной культуры.

2. Разбор серологической классификации сальмонелл.

3. Агглютинация выделенной культуры на стекле с адсорбированными монорецепторными 0- и Н-сыворотками.

Б. Микробиологический диагноз дизентерии (продолжение).

I. Изучение результатов посева, сделанного на предыдущем занятии. Посев подозрительной колонии на МПА, среду Ресселя и среды "пестрого ряда".

В. Микробиологический диагноз эшерихиозов.

1. Посев испражнений больных эшерихиозом детей на среды Эндо и Левина.

Методические указания.

A. Микробиологический диагноз пищевых токсикоинфекций (окончание).

§ 1. Зарегистрировать результаты посева выделенной культуры на среда "пестрого ряда", промикроскопировать посевы на МПА и зарисовать. На основании изучения биохимизма и морфологии выделенной культуры решить вопрос о ее принадлежности к роду сальмонелл и записать в тетради.

§ 2. Разобрать особенности антигенного строения и принципы современной серологической классификации сальмонелл (демонстрация схемы).

§ 3. Поставить реакцию агглютинации выделенной культуры на стекле с адсорбированными монорецепторными 0- и Н-сыворотками.

Результаты реакции агглютинации зарисовать и записать в тетради.

Б. Микробиологический диагноз дизентерии (продолжение).

§ 1. Внимательно рассмотрев посевы на дифференциально-диагностических средах Левина и Плоскирева, найти колонии, подозрительные на дизентерийные (бесцветные, прозрачные). Часть колонии промикроскопировать с окраской по Граму и зарисовать, а оставшуюся часть засеять на скошенный МПА, среду Ресселя, среду Пешкова для определения подвижности и среды "пестрого ряда".

B. Микробиологический диагноз эшерихиозов.

§1. Произвести посев испражнений ребенка, больного эшерихиозом, на чашки с дифференциально-диагностическими средами Эндо и Левина.

Биохимические свойства культуры, выделенной от больного токсикоинфекцией.

Культура	Глю-коза	Лактоза	Манит	Сахароза	Индол	H²S	Молоко	Среда Пешкова

Предварительное заключение: _____________________________________________

______________________________________________________________________________________________________________________________________________

Контрольные вопросы.

Какие микроорганизмы являются основными представителями нормальной кишечной микрофлоры?

Какое значение имеет кишечная микрофлора для организма человека?

В каких случаях возникает дисбактериоз?

Рисунок 1. Микроскопия выделенной культуры сальмонелл. Окраска по Грамму.

Рисунок 2. Реакция агглютинации выделенной культуры сальмонелл с монорецепторными О- и Н-сыворотками.

Заключение____________________________________________________________________________________________________________________________________

Рисунок 3. Бактерии из колонии, подозрительной на дизентерийную. Окраска по Грамму.

Какие препараты применяют для восстановления состава нормальной микрофлоры кишечника?

Почему кишечную палочку считают санитарно-показательным микроорганизмом при загрязнении внешней среды?

Что такое коли-титр и коли-индекс?

Каково антигенное строение кишечной палочки?

Как выделяют чистую культуру диареегенной кишечной палочки?

Какой антиген (0 или К) определяют в реакции агглютинации с живой культурой?

Как обнаруживают специфический 0-антиген у кишечной палочки?

По какому антигену окончательно судят о принадлежности бактерий к патогенному серовару?

Что собой представляют колицины и какое значение имеет определение их типа?

На какие категории и по каким признакам подразделяют диареегенные кишечные палочки?

Какими факторами патогенности обладают энтеротоксигенные кишечные палочки? Каков генетический контроль их синтеза?

Чем обусловлена патогенность энтеропатогенных кишечных палочек?

Чем обусловлена патогенность энтероинвазивных кишечных палочек?

Чем объясняется некоторое антигенное и патогенное сходство энтероинвазивных кишечных палочек и шигелл?

Бактериологическое исследование испражнений при эшерихиозах.

Рисунок 4.

С чем связана патогенность знтерогеморрагических кишечных палочек?

Каков генетический контроль биосинтеза шигаподобных экзотоксинов у энтерогеморрагических вариантов кишечной палочки?

Каков механизм действия термостабильных и термолабильных энтеротокоинов?

Какова молекулярная структура энтеротоксинов?

Каковы основные способы заражения диареегенными кишечными палочками?

Какие категории диареегенных кишечных палочек чаше всего вызывают внутрибольничные вспышки?

Можно ли отличить колонии диареегенных кишечных палочек от колоний непатогенных кишечных палочек на дифференциально-диагностических средах? Если можно, то в каких случаях?

Приложение к занятии 8

А. Семейство кишечных бактерий объединяет группу родственных видов, среди которых много патогенных и условно патогенных представителей. Важнейшими представителями семейства являются бактерии из рода эшерихиа, рода сальмонелла и рода шигелла. Все они - мелкие грамотрицательные аспорогенные палочки, с закругленными концами, размером 0,5-0,8x1,5-3,0 микрона, подвижные или неподвижные, факультативные анаэробы, нетребовательны к питательным средам, ферментируют глюкозу с образованием кислоты и газа или только кислоты, восстанавливают нитраты в нитриты, в большинстве не обладают протеолитическими свойствами, индофенолоксидазоотрицательны; место обитания - кишечник; механизм заражения - фекально-оральный.

Б. Факторы патогенности диареегенных E.coli.

Факторы	Международное название
	Полное	Символы
Термостабильный энтеротоксин
Термолабильный энтеротоксин
Цитотоксины:
Шигаподобный токсин
Vero - токсин
Инвазивность٭
Факторы колонизации٭
Фактор адгезии энтеропатогенных E. coli к клеткам Hep-2
Адгезия к клеткам Henle-407

٭ - имеются в виду CFA/I, CFA/II, CFA/III, CFA/IV. Известны и другие факторы адгезии и колонизации.

В. Классификация диареегенных Escherichia coli.

Категория	Серогруппы	Серовары
ETEC – энтеротоксигенные E. coli	06, 08, 015, 020, 025, 027, 063, 078, 080, 085, 0115, 0128ас, 0139, 0148, 0153, 0159, 0167.	06:Н16, 08:Н9, 011:Н27, 015:Н11, 020:Н-, 025:Н-, 027:Н7, 063, 078:Н11, 0128:Н7, 0148:Н28, 0149:Н10, 0159:Н20, 0167.
EIEC – энтероинвазивные E. coli	028ас, 029, 0124, 0136, 0143, 0144, 0152, 0164, 0167.	028ас:Н-, 0112ас:Н-, 0124:Н, 0124:Н32, 0136:Н-, 0143:Н-, 0144:Н-, 0152:Н-, 0159:Н-, 0164, 0167:Н4, 0167:Н5, 0124:Н30.
EPEC – энтеропатогенные E. coli	Класс 1. 055, 086, 0111, 0119, 0125, 0126, 0127, 0128ав, 0142. Класс 2. 018, 044, 0112, 0114.	018ас:Н7, 020ав:Н26, 026:Н-, 026:НII, 028ас:Н-, 044:Н34, 055:Н-, 055:Н6, 055:Н7, 086а:Н-, 086а:Н34, 0111ав:Н12, 0114:Н10, 0114:Н32, 0119:Н-, 0119:Н6, 0125ас:Н21, 0126:Н-. 0126:Н7, 0127:Н-, 0127:Н9, 0127:Н21, 0128ав:Н2, 0128ас:Н12, 0142:Н6, 0158:Н23, 0159.
EHEC – энтерогеморрагические E. coli	0157, 026, 0111, 0145.	0157:Н7
EAEC – энтероадгерентные E. coli		Не выяснены (провизорная группа)

Г. Классификация сальмонелл (Salmonella).

Род сальмонелл включает свыше 2000 серовариантов.

На основе нумерической таксономии и ДНК-связей в нем выделен единственный вид Salmonella choleraesuis с 6 подвидами: S. choleraesius, S. salamae, S. arisonae, S. diarisonae, S. houtenae, S. bonhori.

Основные биохимические признаки	Подроды
	1	2	3	4	5	6
	Подвиды
	S. choleraesius	S. salamae	S. arisonae	S. diarisonae	S. houtenae	S. bonhori
Лактоза	-	-	+	+	-
Салицин	-	-	-	-	+
Дульцит	+	+	-	-	-	+
Желатин	-	+	+	+	+
d-тартрат	+	-или×	-или×	-или×	-или×
Малонат	-	+	+	+	-
KCN	-	-	-	-	+	+
Тест на β-галактозидазу	-	-или×	+	+	-	+

Примечание: × - ферментация поздно.

Занятие 9.

Дата________

Тема: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ ДИАГНОЗ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ

(продолжение).

План занятия.

A. Микробиологический диагноз дизентерии (окончание).

1. Учет результатов посева на среды "пестрого ряда".

2. Агглютинация выделенной культуры с дизентерийными сыворотками.

3. Колициногенотипирование и определение колициночувствителъности шигелл Зонне. Демонстрация. Опыт зарисовать.

Б. Микробиологический диагноз эшерихиозов (продолжение).

1. Изучение выросших колоний и агглютинация их на стекле со смесью ОК-сывороток.

2. Посев агглютинирующей колонии на скошенный МПА для получения чистой культуры.

B. Микробиологический диагноз холеры.

1. Изучение морфологии и биохимических свойств холерного и холероподобного вибрионов.

2. Исследование испражнений холерного больного: микроскопия, посев на щелочную пептонную воду и щелочный МПА.

3. Ускоренная диагностика холеры (демонстрация).

4. Исследование воды на наличие холерного вибриона (разбор методики).

Методические указания.

A. Микробиологический диагноз дизентерии (окончание).

§ 1. Учесть и зарегистрировать в таблице результаты посева на средах "пестрого ряда", промикроскопировать с окраской по Граму выросшую культуру на МПА, зарисовать ее и сделать ориентировочное заключение о предполагаемом виде бактерий.

§ 2. Определить вид и тип выделенных дизентерийных бактерий с помощью реакции агглютинации на стекле со специфическими видовыми и типовыми дизентерийными агглютинирующими сыворотками. Результаты записать в тетради.

Б. Микробиологический диагноз эшерихиозов (продолжение).

§§ 1-2. Проверить выросшую на среде Эндо или Левина колонию кишечной палочки в ориентировочной реакции агглютинации с поливалентными ОК-сыворотками ОКА,ОКВ,ОКС,ОКД и ОКЕ на стекле. Учет результатов производится по четырехкрестной системе. При отрицательной реакции капля остается гомогенно мутной. Оставшуюся часть колонии, давшей положительную реакцию агглютинации с одной из поливалентных сывороток, необходимо пересеять на скошенный МПА и среду Эндо (Левина). Если агглютинация не происходит, то прежде чем дать отрицательный ответ, в реакции агглютинации на стекле с поливалентными сыворотками ОК испытать не менее 10 различных колоний.

B. Микробиологический диагноз холеры.

§ 1. Приготовить препараты-мазки из чистой культуры водного вибриона, окрасить их по Граму, промикроскопировать и зарисовать. Изучить биохимические свойства холерного и холероподобных вибрионов по демонстрационным наборам сред "пестрого ряда".

§ 2. Приготовить и промикроскопировать с окраской по Граму препарат-маэок из испражнений "холерного" больного, обратить внимание на наличие вибрионов, зарисовать. Одну петлю испражнений засеять на пептонную воду в пробирке, другую петлю испражнений засеять на пластинку щелочного МПА так, чтобы получить изолированные колонии.

§ 3. Для исследования воды без предварительной фильтрации берут ее не менее 1 л, определяют рН, доводят ее насыщенным раствором соды до 7,6-7,8. Затем добавляют к 900 мл воды 100 мл основного раствора пептона (пептона 10 процентов, хлористого натрия 5 процентов, азотнокислого калия 1 процент и углекислого натрия 20 процентов).Засеянную однопроцентную пептонную воду (первая среда обогащения) разливают в колбы и флаконы по 250 мл и ставят в термостат на 5-8 часов. Дальнейшее исследование проводят по обычной схеме.

Регистрация результатов посева дизентерийных бактерий

на среды "пестрого ряда".

Культура	Глю-коза	Лактоза	Маннит	Сахароза	Индол	Серо-водород	Среда Пешкова

Предварительное заключение: _____________________________________________

______________________________________________________________________________________________________________________________________________

Серологическая идентификация выделенной культуры шигелл

(обязательно предварительно учесть биохимические свойства).

Диагностические сыворотки	Результаты
А. Для расщепляющих манит:
1. Основная поливалентная сыворотка, содержащая антитела к шигеллам Флекснера (1-6) и Зонне
2. Поливалентная Флекснера
3. Зонне (содержащая антитела к 1 и 2 фазе) 4. Флекснера 6.
5. Серовароспецифические Флекснера к антигенам I, II, III, IV, V, VI.
6. Групповые Флекснера ( к антигенам 3, 4, 6, 7, 8)
7. Поливалентная Бойда.
8. Серовароспецифические ( к антигенам 1-18) для определения серовара вида Бойда.
9. Моноспецифические Зонне (для фаз I и II)
Б. Для нерасщепляющих манит:
1. Поливалентные к виду шигелла дизентерии (подгруппа А) (1-2; 3-7; 8-10)
2. Серовароспецифические, входящие в данную поливалентную сыворотку для определения серовара (1-12)

Методы микробиологической диагностики холеры.

А. Бактериологический.

Рисунок 1.

Рисунок 2. Выделенная культура шигелл. Окраска по Граму.

Рисунок 3. Вибрион. Окраска по Грамму.

Рисунок 4. Мазок из испражнений"холерного" больного. Окраска по Граму

Рисунок 5. Реакция агглютинации кишечной палочки со смесью ОК-сывороток.

1 - опыт; 2 – контроль.

Методы ускоренной диагностики холеры.

А. Иммунофлуоресцентный.

Рисунок 6.

Мазки обрабатывают люминесцентной сывороткой и рассматривают в люминесцентном микроскопе. При наличии в исследуемом материале холерного вибриона в первом мазке произойдет свечение вибрионов, во втором - свечение отсутствует.

2. Реакция пассивной гемагглютинации.

Для обнаружения холерных вибрионов в содержимом кишечника используют антителъный диагностикум, т.е. эритроциты, на которых предварительно адсорбируют соответствующе антитела. Реакцию ставят по обычной методике. При наличии в исследуемом материале холерных вибрионов происходит агглютинация эритроцитов.

Б. Серологический.

Для серологической диагностики холеры можно использовать реакцию агглютинации, реакцию обнаружения копроантител и реакцию определения титра вибриоцидных антител (бактериолизинов).

Реакцию агглютинации ставят по обычной методике с сывороткой больного, инактивированной нагреванием. В качестве антигена используют 5-часовую агаровую культуру холерного вибриона штамма Огава и отдельно штамма Инаба. Антитела в крови больного появляется с 5-го дня от начала заболевания. Реакция считается положительной при титре сыворотки 1:40 и выше.

0-агглютинины у больных и вибрионосителей можно определить также в инактивированной сыворотке, разведенной 1%-ной пептонной водой от 1:10 до 1:1280 в объеме 1 мл. В пробирки вносят по 0,1 мл 3-часовой бульонной культуры холерных вибрионов. После 2 часов инкубирования при 37° и выдерживания на холоде в течение ночи учитывают результат.

Для определения титра вибриоцидных антител (бактериолизинов) инактивированную сыворотку больного разводят на холоде в растворе комплемента 1:20 в объеме 0,45 мл от 1:10 до 100000. В качестве комплемента использует сыворотку морской свинки, проверенную на отсутствие естественных бактериолизинов. К каждому разведению сыворотки добавляют 0,05 мл суточной агаровой культуры холерных вибрионов с концентрацией 20000 микробных тел в 1 мл. Контролями служат пробирка, в которой отсутствует сыворотка, и пробирка, в которой отсутствует комплемент. Все пробирки инкубируют при 37º в течение 1 часа, затем помещают на холод и микропипеткой высевают по 0,05 мл из каждой пробирки на чашки с питательным агаром. Чашки помещают в термостат и инкубируют при 37°. Через 24 часа подсчитывают количество колоний, выросших на чашках с посевами из опытных и контрольных пробивок. За титр вибриоцидных антител (бактериолизинов) принимают то максимальное разведение сыворотки, при высеве из которого вырастает в 2 раза меньше колоний, чем при высеве из контрольных пробирок.

По аналогичной методике можно определить содержание вибриоцидных антител и в фильтрате содержимого кишечника (испражнений) больного холерой.

Можно определить титр вибриоцидных антител и без предварительной инактивации комплемента и без добавления стандартного комплемента. Исследуемую сыворотку в этом случае наносят каплями (в соответствующем разведении) на чашку с питательной средой, на которую предварительно наносят каплю свежей культуры и рассевают её по всей поверхности среды с помощью шпателя. На месте нанесения капель сыворотки, в которых еще содержатся вибриоцидные антитела и комплемент в достаточном количестве, чтобы вызвать лизис вибриона, роста его не будет ("стерильные пятна").

Для обнаружения антител к холерогену (антитоксинов) в настоящее время применяются иммунофлуоресцентный и иммуноферментный методы.

Кроме того, для обнаружения гена, контролирующего синтез холерогена, разработан метод ДНК-зонда.

Контрольные вопросы.

Каковы морфологические, тинкториальные, культуральные и биохимические особенности холерного вибриона?

Каково антигенное строение холерного вибриона?

По каким признакам отличают семейство Vibrionaceae от семейств Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae?

По каким признакам отличают род Vibrio от родов Aeromonas, PLesiomonas?

По каким признакам отличают холерный вибрион от холероподобных?

Какие существуют биотипы холерного вибриона?

Как происходит заражение при холере?

Где в организме больного локализуется холерный вибрион?

Какие микробиологические методы применяют для диагностики холеры?

Какой материал берут от больного для исследования?

Какой трупный материал подвергают исследованию?

Какие правила следует соблюдать при взятии, пересылке и исследовании материала при подозрении на холеру?

Какие питательные среды применяют для выделения холерного вибриона?

Как выделяют чистую культуру холерного вибриона?

На основании каких признаков идентифицируют холерный вибрион?

Какова сущность иммунофлуоресцентного метода ускоренного обнаружения холерного вибриона?

По каким признакам отличают классический вибрион от вибриона Эль Тор?

Какие токсины образует холерный вибрион? Какое действие оказывает энтеротоксин (холероген) на организм человека?

В чем заключается принцип патогенетического лечения больных холерой?

Как ставят пробу со специфическими холерными монофагами?

В чем заключается биологический метод определения энтеротоксигенности (холерогенности) вибрионов?

Какие серотипы различают у холерных вибрионов?

Какие основные биологические свойства парагемолитических вибрионов? Как происходит заражение ими и какие они вызывают заболевания?

Какое основное отличие галофильных вибрионов от холерных и холероподобных?

Какие метода обнаружения холерогена Вы знаете?

Какова природа и структура холерного энтеротоксина (холерогена)?

Каковы косвенные доказательства отсутствия токсигенных свойств у холерного вибриона?

Какими функциями обладают фрагменты А и В холерогена?

С чем связана способность некоторых холероподобных вибрионов вызывать холероподобные диареи?

Каким образом идентифицируют холероподобные, т.е. не относящиеся к 01-группе, вибрионы?

Приложение к занятию 9.

Возбудитель холеры относится к семейству Vibrionaceae , которое включает в себя несколько родов, в том числе роды: Vibrio, Аеromonas, Plesiomonas.

К роду vibrio относятся грамотрицательные, не образующие спор и капсул палочки, с одним изгибом или прямые, с одним полярно расположенным жгутиком, индофенолоксидазоположительные, образующие кислоту без газа из d-глюкозы путем гликолиза по схеме Эмбден-Мейергофа (до молочной кислоты), имеющие декарбоксилазы лизина и орнитина, лишенные аргининдигидролазы, разжижающие желатину, восстанавливающие нитраты в нитриты и не образующие сероводорода.

Представители рода Aeromonas имеют аргининдигидролазу. Представители рода Plesiomonas имеют все три фермента: лизин- и орнитин-декарбоксилазы и аргининдигидролазу.

Род Vibrio включает следующие виды: V.cholerae, V.parahaemolyticus, V.anguillarum, V.fisheri, V.costicola.

С 1985 года в этот род включено уже более 20 видов.

Вид V.choleгае разделяют на следующие биовары: Vibrio cholerae (в том числе V.eltor), имеющий 01-антиген; V.fincler-prior - включает все холероподобные вибрионы, не относящиеся к 01-серологической группе. По О-антигену холероподобные (НАГ-) вибрионы разделяются на несколько десятков серогрупп. Могут вызывать холероподобные диареи. Вибрионы этих серогрупп идентифицируют с помощью соответствующих О-сывороток.

Характеристика холерных и холероподобных

вибрионов.

Признаки	Вибрионы
	холерные	холероподобные
Форма	в виде запятой	в виде запятой
Подвижность	+	+
Биохимические группы по Хейбергу	I	I-VIII
Агглютинация холерной сывороткой 0-1 подгруппы	+	-
Лизис специфическим монофагом	+
Диастатическая активность	+
Устойчивость к хлору при экспозиции 30 минут	предельная доза 0,4 мг/л воды	предельная доза 0,5-2 мг/л воды

Дифференциальные признаки биоваров холерных вибрионов

(классического и Эль Тор).

Признаки	Биотипы
	классический	Эль Тор
Гемолиз эритроцитов барана	- (+)	+ (-)
Агглютинация куриных эритроцитов	- (+)	+ (-)
Рост на среде с полимиксином (50 ед/мл)	-	+
Лизис фагом С (IV группа Мукерджи) в рабочем разведении (10¯³)	+	-
Лизис фагом Эль Тор 2 в рабочем разведении (10¯¹ - 10¯²)	-	+
Реакция Фогес - Проскауэра	-	+

Холерный вибрион представлен тремя сероварами:

Серотипы	Антигенная формула	Агглютинация сыворотками
		О	Огава	Инаба
Огава	AB	+	+	-
Инаба	AC	+	-	+
Гикошима	ABC	+	+	+

Дифференциальные признаки патогенных и непатогенных

галофильных вибрионов.

Признак	Vibrio parahaemolyticus	Vibrio alginolyticus
Рост в отсутствие NaCl	-	-
Рост в присутствии 7% NaCl	+	+
Рост в присутствии 10% NaCl	-	+
Ферментация сахарозы	-	+
Реакция Фогес - Проскауэра	-	+
Феномен роения	-	+
Гемолиз на среде с 7% NaCl	+	-

Биохимическая характеристика вибрионов по Хейбергу.

Углеводы	Группы
	1	2	3	4	5	6	7	8
Манноза	+	-	+	-	+	-	+	-
Арабиноза	-	-	+	+	-	-	+	+
Сахароза	+	+	+	+	-	-	-	-

ЗАНЯТИЕ 10.

Дата_______

Тема: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ ДИАГНОЗ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ

(окончание).

План занятия.

А. Микробиологический диагноз эшерихиозов (окончание).

1. Постановка реакции агглютинации с живой и гретой культурами кишечной палочки, определение ее серологической группы и серотипа.

Б. Микробиологический диагноз холеры (окончание).

1. Микроскопия препаратов-мазков, приготовленных из пленки на пептонной воде и из колоний на МПА. Агглютинация культур из колоний с холерной О-сывороткой.

В. Изучение иммунопрепаратов, применяемых для профилактики, лечения и диагностики заболеваний, вызываемых бактериями кишечной группы. Демонстрация и разбор.

Г. Правила взятия и пересылки материала при исследовании на кишечную группу микробов. Особенности взятия и пересылки материала при подозрении на холеру. Разбор методов.

Методические указания.

А. Микробиологический диагноз эшерихиозов (окончание).

§ 1. Поставить реакцию агглютинации на стекле выделенной культуры кишечной палочки с поливалентными ок-сыворотками:

ОКА (018ac:K77; 020:К84; 025:KII; 026:К60; 033:К-; 044:К74; 055:К59; 075:К-; 086а:К6I и др. всего 22 серовара).

ОКБ (020:К84; 026:К60; 055:К59; 0IIIав:К58; всего 4 серовара).

ОКС (086a:K61; 0125:K70; 0126:К71; 0127:К63; 0128авc:К67; 0119:К69; 033:К-; всего 7 сероваров).

ОКД (0118ac:K77; 025:KII; 044:К74; 075:К-; 0114:K90;0142:K86; 0143:К-; 0111:К-; "408"; всего 9 сероваров).

ОКЕ (0124:K72; 0142:K86; 0143:K-; 0144:K-; 0151:К-; всего 5 сероваров).

При положительной реакции с одной из поливалентных ОК-сывороток культура далее проверяется в реакции агглютинации на стекле с иммуноглобулинами диагностических ОК-сывороток или с ОК-сыворотками, входящими в состав поливалентной.

Полученные положительные результаты подтверждаются с адсорбированными групповыми сыворотками в реакции агглютинации на стекле с культурой, прогретой в течение часа при 100° С.

При отсутствии иммуноглобулинов и адсорбированных сывороток определение ОК-групп эшерихий проводят при помощи ОК-сывороток в пробирочной реакции агглютинации с живой и гретой (при 100° С - 1 час) культурами. Принадлежность диареегенных кишечных палочек к ОК-группе определяют на основании реакции агглютинации живой культуры с соответствующим ОК-иммуноглобулином или ОК-сывороткой и гретой культуры с адсорбированной групповой О-сывороткой.

Б. Микробиологический диагноз холеры (окончание).

§ 1. Найти на щелочном МПА колонии, подозрительные на колонии холерного вибриона (прозрачные с серо-голубым оттенком) , приготовить из них препараты-мазки, окрасить по Граму и промикроскопироватъ.Промикроскопировать с окраской по Граму пленку, выросшую в посевах на пептонной воде. Поставить реакцию агглютинации на стекле выросшей культуры в колониях с холерной О-сывороткой. Результаты зарисовать и записать в тетради.

Рисунок 1. Культура из колонии, выросшей на щелочном МПА. Окраска по Граму.

Рисунок 2. Культура из пленки на пептонной воде. Окраска по Граму.

Рисунок 3. Реакция агглютинации кишечной палочки с ОК-сыворотками.

Заключение___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Рисунок 4. Реакция агглютинации выделенной культуры вибриона с холерной О-сывороткой.

1 – опыт

2 – контроль

Предварительное заключение_____________________________________________

______________________________________________________________________________________________________________________________________________

ЗАНЯТИЕ 11.

Дата_______

Тема: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ ДИАГНОЗ АНАЭРОБНЫХ ИНФЕКЦИЙ.

План занятия.

1. Изучение особенностей роста культур анаэробов.

2. Морфология анаэробных бактерий. Микроскопия препаратов-мазков из культур патогенных анаэробов.

3. Микробиологический диагноз анаэробных инфекций. Разбор методов диагностики столбняка и газовой гангрены. Посев исследуемого материала по способу Вейон-Виньяля, Фортнера, на среду Тароцци.

.4. Ускоренное обнаружение С.реrfringens. Демонстрация роста на среде Вильсон-Блера, среде Тароцци и на молочной среде.

5. Биологическая проба на мышах для обнаружения ботулинического токсина. Демонстрация, разбор методики.

6. Демонстрация иммунопрепаратов, применяемых для профилактики и лечения анаэробных инфекций.

Методические указания.

§1. Демонстрация роста анаэробов на средах Виллиса-Хоббс, Тароцци, Вильсон-Блера, Цейсслера, на молоке.

§2. Готовые препараты-мазки из чистых культур патогенных анаэробов окрасить по Граму, промикроскопировать. Препараты зарисовать. Обратить внимание на характер расположения спор, отношение к окраске.

§3. Для выделения чистых культур анаэробов берется раневое отделяемое. Исследование начинается с предварительной микроскопии исходного материала. Для этого готовят мазки и окрашивают по Граму. Обратить внимание на наличие капсул. Препараты зарисовать.

Посев производится на регенерированную, то есть предварительно прогретую на кипящей водяное бане в течение 10-20 минут для освобождения от растворенного в ней кислорода, среду Тароцци. Пастеровской пипеткой взять каплю гноя и, наклонив пробирку со средой Тароцци, по верхней стенке осторожно ввести каплю гноя на дно пробирки так, чтобы не попал воздух.

§4. Посев раневого отделяемого на среду Вильсон-Блера. Среда Вильсон-Блера предварительно расплавляется и выдается студентам в пробирках. Перед посевом ее необходимо охладить до температуры 40-45°С. Раневое отделяемое предварительно развести в стерильном физиологическом растворе. Для этого каплю исследуемого материала внести в пробирку с физиологическим раствором. Затем после перемешивания из этой пробирки каплю внести в пробирку со средой Вильсон-Блера, тщательно перемешать путем вдувания и выдувания содержимого и быстро набрать среду в трубки Вейон-Виньяля. Трубки положить в горизонтальном положении и дать им остыть. Концы трубок закрыть ватой.

§6. Демонстрация препаратов, применяемых для профилактики и лечения анаэробных инфекций.

Рисунок 1. Патогенные анаэробы. Окраска по Граму.

Рисунок 2. Анаэробы в раневом отделяемом. Окраска по Граму.

Ускоренный метод диагностики возбудителей газовой гангрены

по способу Комковой.

Исследуемый материал вносят в 10 пробирок с полужидкой средой и затем 5 пробирок прогревают при 80º 20 минут. После этого в каждую пробирку добавляют различные моновалентные противогангренозные сыворотки.

Обнаружение через 10-18 часов микробов стрептобациллярной формы и роста их изолированными колониями подтверждает соответствие возбудителя типу сыворотки. Диффузный рост и беспорядочное расположение бацилл указывает на несоответствие возбудителя типу сыворотки.

Методы микробиологической диагностики ботулизма.

А. Бактериологический (по классической схеме с последующей биологической пробой). См. схему на след.стр.

Методы микробиологической диагностики газовой гангрены.

Бактериологический.

Исследование проб на наличие патогенных клостридий.

Исследуемый материал.

Посев на среды:				Посев по 1 мл в жидкие питательные среды - мясные или казеиновые (5 пробирок): 1-я пробирка - непрогретая, 2-я - прогрев при 80° - 15 минут, 3-я - прогрев при 100º - 5 минут, 4-я - прогрев при 100º - 10 минут, 5-я - прогрев при 100º - 20 минут. Инкубация при 37º 1-15 суток.
в чашках		в пробирке
Кровяной МПА	Среда Виллиса-Хоббс		Среда Вильсон-Блера
Анаэробные условия
Инкубация при 37ºС 1-7 суток
Микроскопия, изоляция и пересев на мясную или казеиновую среду колоний, вызывающих гемолиз, опалесценцию или почернение на одной из указанных выше сред и состоящих из грамположительных палочек.				Выросшие культуры, содержащие массу грамположительных палочек, подвергают дальнейшему изучению.
Изучение свойств выделенных культур.				Проверка токсичности фильтратов или центрифугатов на мышах или морских свинках.	Посев на плотные питательные среды: чашки с кровяным МПА, со средой Виллиса-Хоббс, с бензидиновым МПА, столбик агара Вильсон-Блера.
				Реакция нейтрализации с сыворотками: C.perfringens типа А, С. novyiтипа А, В, C. septicum, C. sordellii, C.histolyticum.	Инкубация при 37° 1-4 суток. Изоляция колоний, вызывающих гемолиз, опалесценцию или почернение на питательных средах. Изучение свойств выделенных культур.

Б. Биологический.

Для обнаружения токсина и его типа в реакции нейтрализации.

Для обнаружения токсина двум мышам вводят исследуемый фильтрат в количестве 0,5 мл внутрибрюшинно, другим двум мышам вводят смесь, состоящую из 0,5 мл фильтрата и 0,2 мл смеси диагностических моновалентных противоботулинических сывороток типа А,В,С,Е (соединяют по 0,5 мл сыворотки каждого типа). Перед введением смесь испытуемого материала и сывороток выдерживают при комнатной температуре в течение 30 минут. Наблюдение за животными ведут в течение 4 дней. При наличии токсина погибают первые две мыши, остальные остаются живы.

Рисунок 3. Ускоренный метод обнаружения C.perfringens.

Одна пробирка каждой среды после внесения материала прогревается при 80°С 20 минут.

Почернение среды Вильсон-Блера в течение 3-х часов и бурное створаживание молока в течение 6 часов характерны для C.perfringens.

При обнаружении токсина ставят развернутую реакцию нейтрализации для определения типа токсина. Для этого в 5 пробирок разливают по 2,4 мл испытуемого фильтрата и в каждую пробирку прибавляют по 0,6 мл сыворотки раздельно типа А, типа B, типа С и типа Е. В 5-ю пробирку прибавляют 0,6 мл физиологического раствора. Смесь после 30 минут выдерживания при комнатной температуре вводят внутрибрюшинно по 1 мл 2 мышам из каждой пробирки отдельными шприцами. Наблюдают за животными в течение 4 дней. При наличии токсина выживают мыши, получившие смесь токсина и гомологичной сыворотки, остальные мыши гибнут. Тип сыворотки, нейтрализующей токсин, указывает на типовую принадлежность токсина.

В. Ускоренные методы диагностики ботулизма:

а) обнаружение токсина с помощью РПГА (на эритроцитах адсорбируют антитоксин)

б) обнаружение токсина с помощью реакции угнетения фагоцитоза. Ботулинический токсин резко угнетает фагоцитарную способность лейкоцитов в связи с наличием у токсина лейкотоксических свойств. При этом фагоцитарный показатель уменьшается в 3,5, 10 и даже 20 раз. При добавлении к крови, содержащей токсин, гомологичной антитоксической сыворотки фагоцитарная способность лейкоцитов восстанавливается.

Контрольные вопросы.

Каковы основные биологические свойства анаэробных бактерий?

Какова роль анаэробных бактерий в патологии человека?

Какие заболевания вызывают анаэробные бактерии?

Каков механизм заражения при газовой гангрене?

Что является средой обитания анаэробных бактерий в естественных условиях?

Какие возбудители чаще всего вызывают газовую гангрену?

Какие токсины образуют возбудители газовой гангрены и на что они действуют?

Каковы особенности патогенеза газовой гангрены?

Какие условия способствуют развитию газовой гангрены?

По каким основным признакам различаются между собой c.perfringens, C.novyi, C.septicum, C.histolyticum?

Какие ускоренные методы применяются для обнаружения c.perfringens?

Какие микробиологические методы используются для диагностики анаэробных инфекций?

Каковы основные морфологические, культуральные и биохимические особенности возбудителя столбняка?

Какова природа токсина столбнячной палочки и на что он действует?

Чем отличается картина столбняка у человека и у мелких лабораторных животных?

Что является средой обитания для столбнячной палочки?

Чем объясняется высокая обсемененность почвы столбнячной палочкой в Краснодарском крае?

Каковы основные морфологические и биологические свойства возбудителя ботулизма?

Какова природа токсина палочки ботулизма? Какие типы токсина продуцирует возбудитель и что поражает токсин?

Какие условия способствуют размножению возбудителя ботулизма и накоплению токсина в пищевом продукте?

Какой материал берется для исследования при подозрении на ботулизм?

Какие методы применяются для обнаружения токсина возбудителя ботулизма и определения его типа?

Какие продукты чаще всего являются причиной отравления при ботулизме?

Как осуществляется специфическая профилактика и лечение ботулизма? Какие препараты применяются для этой цели?

Что представляет собой прототоксин?

Какова природа и структура столбнячного токсина?

Как активируется столбнячный токсин?

Что поражает столбнячный токсин?

Каковы функции тяжелой и легкой цепей столбнячного токсина?

Как продвигается столбнячный токсин к ядрам двигательных нервов?

Каков защитный уровень антитоксина против столбнячного токсина?

Как осуществляется специфическое лечение и специфическая профилактика столбняка?

Как обеспечивается формирование коллективного иммунитета против столбняка и какие препараты применяют для этой цели?

Что такое прогенитарные токсические комплексы, образуемые палочкой ботулизма?

Какие структурные варианты прогенитарных токсических комплексов Вы знаете? Каков их состав?

Как происходит активация ботулинического токсина?

Какая разница между протеолитическими и непротеолитическими вариантами возбудителя ботулизма? Каким образом осуществляется у них активация токсина?

В чем заключается механизм активации ботулинического токсина?

Какие функции выполняют нетоксические белки в составе белковых комплексов?

Каковы физико-химические свойства токсина ботулизма? Какие токсины, кроме нейротоксина, образует возбудитель ботулизма?

Ботулизм - интоксикация или токсикоинфекция?

Что поражает ботулинический токсин?

Какой синдром чаще всего наблюдается у больных ботулизмов?

ЗАНЯТИЕ 12.

Дата_______

Тема: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ ДИАГНОЗ АНАЭРОБНЫХ ИНФЕКЦИЙ

(окончание).

План занятия.

A. Микробиологический диагноз анаэробных инфекций.

Регистрация результатов посева материала, содержащего анаэробные микробы, макро- и микроскопия выросших культур.

Б. Микробиологический диагноз дифтерии.

1. Изучение морфологии и культуральных свойств дифтерийной палочки. Макро- и микроскопия культур бактерий.

2. Типы дифтерийных бактерий. Демонстрация роста культур соответствующих типов на теллуритовых средах и их биохимических свойств.

3. Биохимические свойства коринебактерий. Дифференциация истинных дифтерийных бактерий от псевдодифтерийных и дифтероидов по биохимическим свойствам. Демонстрация и разбор.

4. Правила взятия и пересылки материала от больного дифтерией для бактериологического исследования. Разбор.

5. Бактериологическая диагностика дифтерии. Исследование дифтеритической пленки (или материала от бактерионосителя). Посев на теллуритовые среды.

6. Определение токсигенности дифтерийных бактерий методом преципитации в агаре и биопробой на морской свинке. Разбор и демонстрация.

B. Ми-кробиологический диагноз коклюша.

Изучение морфологии и культуральных свойств коклюшной палочки.

Микробиологическая диагностика коклюша. Разбор схемы.

Г. Знакомство с иммунопрепаратами, применяемыми для профилактики и лечения дифтерии и коклюша.

Методические указания.

А. Микробиологический диагноз анаэробных инфекций.

1. Зарегистрировать результаты посева материала, содержащего анаэробные микроорганизмы. Приготовить препарат-мазок, окрасить по Граму и зарисовать.

Б. Микробиологический диагноз дифтерии.

§1. Готовые фиксированные мазки из чистой культуры дифтерийной палочки окрасить синькой Леффлера и по Нейссеру. Дифтерийные бактерии окрашиваются неравномерно, более интенсивно окрашиваются зерна волютина. При окраске метиленовым синим .наблюдается явление метахромазии. По способу Нейссера зерна окрашиваются в темно-коричневый цвет. Дифтерийные палочки располагаются под углом друг к другу в виде римской цифры V. Препараты промикроскопировать и зарисовать.

Знакомство с характером роста возбудителя дифтерии на свернутой сыворотке, на таллуритовых средах.

§2. Демонстрация роста различных типов дифтерийной палочки на теллуритовой среде. Разбор биохимических свойств различных типов дифтерийной палочки по демонстрационным наборам.

§3. Знакомство с биохимическими свойствами дифтерийной палочки по биохимическим наборам. Демонстрация и разбор. Заполнить таблицу.

§ 4. Исследованию подвергаются слизь или пленка из зева, носа, носоглотки, миндалин. Реже исследуется материал с конъюнктивы глаза, со слизистой оболочки половых органов или с поверхности ран. Материал берут стерильным тампоном. Тампон погружают в стерильную пробирку с этикеткой, на которой указаны фамилия, имя, отчество, возраст больного и из какого места (полости) взят материал. Пробирки с материалом помещают в металлические пеналы и с нарочным отправляют в лабораторию для доследования. Разбор методики взятия материала из зева, носа и других мест и посева его при дифтерии.

§5. С помощью стерильного ватного тампона произвести друг у друга забор материала со слизистой зева или носа и сделать посев на сывороточную среду с теллуритом.

§6. Методика определения токсигенных свойств возбудителя дифтерии преципитацией в агаре заключается в следующем. Полоски фильтровальной бумаги размером 1,5x8 см, простерилизованные в автоклаве, смачивают антитоксической противодифтерийной сывороткой, разведенной стерильным физиологическим раствором до содержания 500 АЕ в 1 мл. Смоченную сывороткой бумажку стерильным пинцетом переносят на поверхность питательной среды в чашку Петри. Чашку подсушивают в термостате 15-20 минут. Испытуемые культуры засевают бляшками по обе стороны от фильтровальной бумажки. На одну чашку засевают несколько штаммов, один из которых заведомо токсигенный и служит контролем. Чашки с посевом помещают в термостат при температуре 37°С. Результат учитывают в течение 48 часов. В месте взаимодействия антитоксина с токсином образуется линия преципитации. Если исследуемая культура образует токсин, то ее линия преципитации сливается с линией преципитации контрольного штамма, образуя сплошную белую полоску. При неспецифической преципитации линия, образуемая исследуемым штаммом, пересекает или имеет тенденцию к пересечению с линией контрольного штамма.

Демонстрация чашек с культурами токсигенной и нетоксигенной дифтерийной палочки. Зарисовать схему определения токсигенных свойств возбудителя дифтерии.

Определить токсигенные свойства дифтерийной палочки можно также методом биопробы. Для опыта берут двух морских свинок, накануне одной из них вводят 500-1000 АЕ антитоксической противодифтерийной сыворотки. Затем свинкам вводят подкожно (0,2 мл) или внутрикожно (0,1 мл) исследуемую культуру. Если испытуемая культура токсигенна, то при подкожном введении опытная свинка через 2-5 дней погибает. При вскрытии обнаруживается отек в месте введения культуры, экссудат в брюшной и грудной полостях и в перикарде. Особенно характерным симптомом является увеличение и гиперемия надпочечников. Контрольная свинка остается живой. При внутрикожном введении токсигенной культуры у опытной свинки в месте инъекции наблюдается покраснение, отечность, а в дальнейшем - некроз. У контрольной морской свинки никаких изменений не отмечается.

В. Микробиологический диагноз коклюша.