8.1.2. Схема синтеза дочерней днк
Синтез дочерней ДНК происходит на каждой одиночной цепи материнской ДНК в области репликационной вилки. Он осуществляется с помощью специального фермента ДНК-полимеразы. ДНК-полимераза катализирует синтез ДНК из дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (дНТФ), комплементарных нуклеотидам ДНК-матрицы. Синтез происходит путем последовательного наращивания образующейся дочерней цепи, комплементарной родительской матрице, одиночными звеньями шаг за шагом. Особенностью ДНК-полимеразы является то, что она способна только добавлять звенья
Механизм и направление синтеза определяются следующими правилами.
1. Для начала синтеза необходимо существование начальной затравки – праймера (от англ. primer – затравка), так как ДНК-полимераза способна только добавлять новые звенья к уже имеющейся полинуклеотидной цепи, но она не может самопроизвольно начать синтез дочерней ДНК. Роль праймеров выполняют короткие РНК (длиной около 10 нуклеотидов), комплементарные определенным участкам матричной цепи. Праймеры синтезируются из рибонуклеозидтрифосфатов специальным ферментом, называемым ДНК-праймазой.
2. Синтез дочерней цепи ДНК осуществляется ДНК-полимеразой всегда в направлении от 3´- к 5´-концу матричной цепи (или от 5´- к 3´-концу новой синтезируемой цепи).
3. Так как рост дочерней цепи всегда происходит в направлении от 5´- к 3´-концу, то он осуществляется благодаря взаимодействию дНТФ с 3´-ОН концевым нуклеотидом уже построенной цепи ДНК. При этом отщепляется пирофосфат и образуется фосфодиэфирная связь. Напомним, что в молекулах РНК комплементарным к основанию А является урацил (У), а не тимин (Т), как в цепях ДНК.
4. Выбор очередного нуклеотида диктуется родительской матрицей. Скорее всего, этот процесс происходит путем перебора всех альтернативных нуклеозидтрифосфатов. Присоединение каждого нуклеотида к 3´–концу растущей цепи сопровождается гидролизом связи между первым и вторым фосфатными остатками в дНТФ и отщеплением пирофосфата, что делает реакцию энергетически выгодной.
5. ДНК-полимераза в процессе синтеза проверяет комплементарность каждого присоединяемого нуклеотида соответствующему нуклеотиду матричных цепей. Проверка осуществляется дважды: сначала перед включением нового нуклеотида в состав растущей цепи и повторного – перед включением следующего нуклеотида. Очередная фосфодиэфирная связь синтезируется только в случае, если последний нуклеотид образовал правильную уотсон-криковскую пару с соответствующим нуклеотидом матрицы. При обнаружении ошибки фермент перемещается в обратном направлении и вырезает последнее звено, после чего синтез продолжается. Способность фермента вырезать неправильное звено связана с тем, что кроме активности синтеза в направлении 5´–3´ дочерней цепи, ДНК-полимераза обладает также 3´-гидролизирующей активностью, необходимой для удаления ошибочно спаренного нуклеотида. Такая система проверки обеспечивает чрезвычайно высокую степень точности репликаций. При воспроизведении генома млекопитающего, включающего около 3 миллиардов пар нуклеотидов, обычно возникает не более трех ошибок при скорости синтеза до 50 нуклеотидов в секунду.
Из сказанного следует, что синтез дочерних цепей на верхней и нижней расплетенных цепях ДНК у правой и левой репликационных вилок должен происходить по-разному. На рис. 8–1 показан синтез на верхней матричной цепи на правой репликационной вилке, то есть с правой части «глазка». Видно, что направления движения ДНК-полимеразы и репликационной вилки совпадают только для верхней цепи (рис. 8–1 и рис. 8–2) расплетенной ДНК. Синтез новой цепи на ней, инициированный одной РНК-затравкой, расположенной вблизи точки начала репликации, идет непрерывно. Эта цепь получила название ведущей цепи.
На нижней цепи при движении той же репликационной вилки (рис. 8–2) синтез осуществляется следующим образом. Для начала синтеза на второй цепи, также как и на первой, в области глазка образуется затравка (праймер) РНК. После образования праймера, ДНК полимераза начинает синтез ДНК, двигаясь влево от 3´- к 5´-концу нижней цепи ДНК, в направлении противоположном направлению движения рассматриваемой репликационной вилки. При дальнейшем движении вилки вправо образуется следующий нереплицированный одноцепочечный участок материнской цепи. Его длина увеличивается до тех пор, пока не появляется новый участок, имеющий сродство к праймазе и синтезируется новый праймер РНК. Как только он образовался, с ним связывается ДНК-полимераза, синтезирующая новый фрагмент ДНК. При этом ДНК-полимераза движется в направлении от вилки влево до тех пор пока не соприкоснется с предыдущим праймером (предыдущей затравкой РНК).
При движении вилки периодически возникают все новые и новые праймеры, на которых по мере их появления, начинается синтез фрагментов ДНК. Поэтому вторая ветвь получила название запаздывающей (отстающей). Таким образом, запаздывающая ветвь состоит из серии РНК-затравок (праймеров), разделенных относительно короткими фрагментами, длиной от 100 до 1 000 нуклеотидов, получившими название фрагментов Оказаки, по фамилии автора, их открывшего.
В отличие от ведущей цепи в синтезе отстающей цепи принимает участие большое число ДНК-полимераз. На отстающей цепи, РНК-затравки синтезируются ДНК-праймазой, молекула которой непосредственно связана с ДНК-хеликазой, образуя структуру, называемую праймосомой. Праймосома движется в направлении раскручивания нитей и во время движения синтезирует РНК-затравки. После синтеза цепей ДНК, РНК-затравки удаляются, а образовавшиеся промежутки достраиваются ДНК-полимеразой и сшиваются ферментом ДНК-лигазой, катализирующей образование фосфодиэфирной связи между группами 3´-ОН и ´5-фосфатной группой соседних фрагментов. Это приводит к образованию непрерывной двойной молекулы ДНК.
Рис. 8–2. Правая часть репликационной вилки. Для новосинтезированной ведущей цепи направление синтеза ДНК совпадает с направлением расплетения двойной спирали ДНК (слева направо). Отстающая ветвь синтезируется прерывисто, в виде коротких фрагментов Оказаки в противоположном расплетению ДНК направлении. Обе дочерние ветви растут от 5´ конца к 3´ концу
Итак, в классическом варианте синтез дочерних цепей ДНК начинается сразу же в месте расплетения цепей после образования праймеров. Если верхняя цепь расположена, как показано на рис. 8–1, 8–2, слева направо от 3´- к 5´-концу, то РНК-затравка на ней ориентирована антипараллельно: от 5´- к 3´-концу. ДНК-полимераза наращивает нуклеотиды к 3´-концу затравки и движется непрерывно вправо вслед за правой репликационной вилкой.
Соответствующая этой репликационной вилке дочерняя цепь ДНК формируется на запаздывающей нижней цепи на фрагментах Оказаки, как описывалось выше, при движении ДНК–полимераз справа налево.
Вторая (левая) репликационная вилка движется от места расплетения влево, в направлении от 5´- к 3´-концу верхней матричной цепи. На верхней цепи синтез может осуществляться только вправо, то есть в обратном направлении по отношению к движению репликационной вилки. Поэтому синтез дочерней ДНК на ней происходит так же, как на запаздывающей цепи, с образованием фрагментов Оказаки. На нижней цепи синтез ДНК от праймера, образующегося в месте расплетения, происходит от точки начала репликации влево, то есть в направлении движения репликационной вилки.
Таким образом, верхняя цепь вправо от точки начала репликации является ведущей, а влево – запаздывающей. Нижняя цепь, наоборот, вправо является запаздывающей, влево – ведущей.