Глава 7. Выделение гамма-глобулина

Широкое практи­ческое применение в настоящее время имеет метод очистки, сводящийся к выделению гамма-глобулиновой фракции иммунных сывороток. Наиболее детально этот метод изучен приме­нительно к получению так называемого «коревого» гам­ма-глобулина из человеческой крови:

В последние годы интенсивно изучаются методы выделения гамма-глобулина из гипериммунных сыворо­ток против клещевого энцефалита, бешенства, лептоспироза, сибирской язвы. Обнадеживающие резуль­таты получены при выделении гамма-глобулина из некоторых антитоксических сывороток.

Принцип метода сводится к фракционированию сывороток спиртоводными осадителями при разных значе­ниях рН и при температуре ниже нуля. Целью фракци­онирования является отделение иммунного гамма-глобулина от альбумина, альфа- и бета-глобулинов. Очи­стка проходит в три стадии.

1 стадия. Условия: концентрация спирта 25%, Т С° 5 °С, рН 6,8-7,2

В осадок выпадает гамма-глобулиновая фракция; кроме того, он содержит значительные примеси, главным обра­зом, бета-глобулина. Раствор, содержащий альбуми­ны, а также часть альфа- и бета-глобулинов после отде­ления осадка путем фильтрации или центрифугирования выбрасывают. Осадок растворяют в солевом растворе (0,01 М - NаС1), после чего осуществляется вторая стадия очистки.

2 стадия. Условия: концентрация спирта 13-17 %, Т С° -3…-6 °С, рН 5,1

В осадок выпадает бета-глобулин, липоидные вещества и небольшое количество альфа- и гамма-глобулинов. После отделения осадка раствор, содержащий очищенный гам­ма-глобулин, подвергается дальнейшей обработке.

3 стадия. Условия: концентрация спирта 25-26 %, Т С° 5…6,5 °С, рН 7,0-7,2, NаС1 0,05-0,07 мл

В осадок выпадает гамма-глобулин.

Для лучшей очистки гамма-глобулина допускается переосаждение белковых осадков, полученных на 1-й и 3-й стадиях очистки. Повторным извлечением гамма-глобулина из балластных белков после 2-го осаждения достигается повышение выхода.

Конечный выход гамма-глобулина составляет 8-10 % от общего белка сыворотки. Для удаления спирта и получения в сухом виде осадок подвергается сублима­ционному высушиванию.

Сухой гамма-глобулин до растворения может сохра­няться в вакуум-эксикаторе над хлористым кальцием или иным поглотителем влаги не долее одного месяца.

Дальнейшей обработке может подвергаться и сырой осадок, максимально освобожденный от спирта путем суперцентрифугирования и отстаивания в течение 12-18 часов при температуре -5 °С.

При изготовлении жидкого гамма-глобулина осадок растворяется в физиологическом растворе или дистиллированной воде (если растворяется сухой осадок, в кото­ром содержится NаС1) так, чтобы довести количество белка до 10—10,5 %. Содержание NаС1 в растворе долж­но быть доведено до 0,85 %. В качестве консерванта к препарату добавляется мертиолят в конечной концентрации 1:15000.

В 10 %-ном растворе гамма-глобулина устанавлива­ется рН 7,0-7,5 и с помощью рефрактометра точно про­веряется количество белка. После этого раствор подвер­гается стерилизующей фильтрации при температу­ре 2-8 °С.

Разливка в ампулы производится после проверки-стерильности. Готовый препарат должен быть прозрач­ным или слегка опалесцирующим и содержать 10 % бел­ка. Каждая серия контролируется методом электрофоре­за. Выпуск препарата допускается в том случае, если гамма-глобулиновая фракция составляет 97 % от коли­чества общего белка.

Содержание спирта в готовом препарате в тех слу­чаях, если обработке подвергался сырой осадок, не должно превышать 4,5 %. Каждая серия профильтрован­ного гамма-глобулина подвергается контролю на сте­рильность и безвредность. Отличие от контроля безвред­ности сывороток заключается в количестве вводимого пре­парата (свинке вводится 1 доза гамма-глобулина) и длительности срока наблюдения (за мышами наблю­дают 4 дня). Годным признается препарат, не вызываю­щий общих и местных реакций в течение периода на­блюдения.

Препараты гамма-глобулина должны сохраняться при температуре 4-10 °С. Срок годности их полтора года; по истечении этого срока, если препарат не изме­нил своих физических свойств, он может применяться в течение еще одного месяца.