Тема 11. Использование в вирусологии культур клеток. Культивирование вирусов в культуре клеток

Цель занятия: ознакомиться с методом получения первично трипсинизированной культуры клеток из тканей куриного эмбриона.

Оборудование и материалы: куриные эмбрионы 9-12 дневной инкубации, чашки Петри, колбочки по 100 мл, фильтр марлевый, центрифужные пробирки, пробирки стерильные с резиновыми пробками, пипетки, воронки, трипсин, среда 199, раствор Хенкса, центрифуга, магнитные мешалки, магнитики, камеры Горяева, микроскопы, лед, овоскоп, мультимедийное оборудование, презентации по теме занятия.

Методика проведения занятия и методические указания по теме.

Объяснение преподавателя. Метод культуры клеток заключается в том, что от убитого животного как можно быстрее после клинической смерти берут ткань или клетки и до наступ­ления биологической смерти помещают их в соответствующие питательные сре­ды и условия, обеспечивающие поддержание процессов жизнедеятельности. Наряду с множеством других преимуществ метод культуры тканей относительно дешев и поэтому может быть использован массово.

11.1 Метод трипсинизации. Культуры клеток из куриных эмбрионов методом трипсинизации готовят по следующей методике:

1. Подготовка куриных эмбрионов

а) овоскопирование

б) дезинфекция

в) извлечение, измельчение

г) промывание в растворе Хенкса.

2. Трипсинизацию проводят на магнитной мешалке в течение 10 минут подогретым до 35°С 0,25% раствором трипсина. Колбу помещают на тающий лед. Оставшиеся кусочки заливают новой порцией трипсина и трипсинизируют до истощения ткани.

3. Отделение клеток от трипсина.

Взвесь клеток в трипсине центрифугируют 10 минут при 1000 об/мин. Клеточный осадок ресуспендируют в небольшом количестве ростовой питательной среды.

4. Подсчет клеток.

Определяют количество клеток в 1 мл суспензии в камере Горяева. Считают клетки в 10 больших квадратах, среднее умножают на 22 000. Подсчет клеток необходим для того, чтобы получить хороший монослой. Для клеток куриного эмбриона оптимальная доза 250-500 тысяч клеток в 1 мл суспензии.

5. Посев клеток.

Вносят в каждую пробирку по 1 мл клеточной суспензии в ростовой среде. Пробирки закрывают резиновыми пробками, помещают на подставку под углом 5-7° и ставят в термостат при +37°.

Рост клеток будет заметен через 12-14 часов после посева, но хороший монослой образуется только через 2-3 дня. Ежедневно культуры просматривают под малым увеличением микроскопа для определения характера роста.

Метод холодной трипсинизации (рис. 28) используют для диспергирования тканей почек, полученных от поросят, телят, ягнят, кроликов, собак, хомяков, а также почек взрослых животных и других тканей. Метод включает следующие этапы:

а) корковый слой почки срезают и измельчают на кусочки размером 2 – 5 мм, ткань многократно (3–4 раза) промывают раствором Хенкса до полного освобождения от эритроцитов;

б) отмытые кусочки ткани переносят в трипсинизационную колбу и добав­ляют 0,25%-ный раствор трипсина, в котором перемешивают ткань 10 – 30 мин. После осаждения кусочков ткани надосадочную жидкость сливают и выбрасы­вают;

в) в колбу добавляют свежий раствор трипсина и помещают ее на магнитную мешалку. Скорость вращения регулируют так, чтобы не было разбрызгивания и вспенивания жидкости. Перемешивание продолжают в течение ночи (12–16 ч) при 4-6°С;

г) утром суспензию фильтруют через 2 – 3 слоя марли или сетку из нержаве­ющей стали в центрифужные флаконы;

д) клетки осаждают центрифугированием при 400 –600 об/мин 20 – 30 мин. Трипсин удаляют;

Рисунок 28. Последовательность приготовления почечной культуры клеток. 1 – измельчение коркового слоя; 2 – трипсинизация; 3 – осаждение диспергирован­ных клеток центрифугированием, 4 – подсчет живых клеток в гемоцитометре; 5 – диспергирование клеток в среде выращивания, во флаконах Ру; 6 – снятие первично­го монослоя культуры клеток с помощью трипсиноверсеновой смеси, процедура повторного осаждения и подсчета клеток; 7 – суспендирование клеток в среде роста, розлив по пробиркам и инкубация их в стационарных условиях до заражения вирусом

е) осадок клеток промывают в ростовой среде центрифугированием. Отмы­тые клетки ресуспендируют в ростовой среде, определяют концентрацию, дово­дят ее до посевной и разливают суспензию клеток в сосуды для культивирования.

11.2 Номенклатура культур тканей и клеток. В 1966 г. предложена унифицирован­ная терминология для тканевых культур животных. Основные положения ее при­водятся ниже.

Культура тканей (tissue culture; Gewebekultur) – сборное понятие, обознача­ющее систему, в которой клетки, ткани или органы сохраняют жизнеспособ­ность или способность размножаться in vitro более 24 ч. В зависимости от вида биологического объекта различают: культуру клеток (cell culture; Zellkultur) – термин, который обозначает рост клеток in vitro и включает в себя также рост единичных клеток (клетки в культуре не образуют ткань); культуру тканей или органов (tissue or organ culture; Gewebe oder organ Kultur) – термин, который обозначает поддержание роста тканей, зачатков органов или их частей in vitro при сохранении их дифференцировки, структуры и (или) функции.

Эксплантат (explant; Explantat) – вырезанный кусок ткани или органа, ис­пользуемый для культуры in vitro.

Однослойная культура клеток, монослой (monolayer; einschkhtiger Zellrasen) – клетки, растущие в один слой на определенной поверхности. Клеточный штамм (cell strain, Zellstamm) выводится из первичной культуры или из клеточной линии путем селекции или клонирования клеток со специфи­ческими свойствами (маркерами) Эти маркеры должны сохраняться во время дальнейшего культивирования При описании штамма необходимо ха­рактеризовать его свойства, например наличие определенного хромосомного набора, специфических антигенов, устойчивости к определенному вирусу.

Подштамм (substrain, Unterstamm) можно получить из штамма путем изоля­ции единичной клетки или группы клеток, обладающих свойствами, которыми не обладают остальные клетки штамма

Клон (clone, Klon) – популяция клеток, полученная путем деления (митоза) одной клетки Клон не всегда однороден и не должен быть таким, поэтому нельзя использовать термины «клон» или «клонированный» для обозначения однород­ной популяции клеток.

Клонированный штамм или линия (clone strain or line, geklonter Stamm oder geklonte Lime) – штамм или линия, выведенные из одного клона.

Время генерации клеток (cell generation time; Zellgenerationszeit) – интервал между последующими делениями клеток. Лучше всего определять с помощью микрофотографии. Термин этот не идентичен термину «время удвоения популя­ции».

Время удвоения популяции (population doubling time; Verdopplungszeit). Термин касается всей популяции и определяет время, за которое количество клеток воз­растает, например с 1 х 10⁶ до 2 х 10⁶.

Абсолютная эффективность посева (absolute plating efficiency; absolute Aussaateffektivitat) – процент единичных клеток, которые после внесения в сис­тему для выращивания (посев) образуют колонии. Обязательно всегда сообщать общее число введенных клеток, тип посуды и условия (род питательной среды, температура, открытая или закрытая система, атмосфера, С0₂ и т. д.).

Относительная эффективность посева (relative plating efficiency; relative Aussaateffektivitat) – процент посеянных клеток, образующих колонии по отно­шению к контролю, в котором за 100 % принимается абсолютная эффектив­ность посева. Необходимо всегда сообщать общее число введенных клеток, ус­ловия выращивания и абсолютную эффективность посева в контроле.

Самостоятельная работа студентов.

а) изучение техники получения первичных трипсинизированных культур по методике.

б) получение первично-трипсинизированных культур клеток из куриных эмбрионов.

Контрольные вопросы:

1. Методика получения первично трипсинизированных культур клеток по методу Дюльбекко и Фогт.

2. Сущность трипсинизации, техника проведения.

3. Для чего посуду закрывают резиновыми пробками.

.