ЗАНЯТИЕ № 2.3
«ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ. ОСНОВЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ»
ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ:
Изучить наследственность и изменчивость микробов; виды генетических рекомбинаций; внехромосомные факторы наследственности и их роль в формировании лекарственной устойчивости
СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ:
Особенности генома бактериальной клетки, его отличия от генома эукариот и вирусов.
Функционирование бактериальных генов (особенности репликации и транскрипции прокариот).
Внехромосомные детерминанты наследственности - IS-элементы, транспозоны, плазмиды, их функции.
Плазмиды патогенности, их роль.
Механизмы, обусловливающие изменчивость микроорганизмов (адаптации, мутации, рекомбинации).
Механизмы передачи генетического материала у бактерий (конъюгация, трансформация, трансдукция).
Причины возникновения и циркуляции антибиотикорезистентных штаммов
СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ:
интерпретировать результаты опытов по фенотипической и генотипической изменчивости микроорганизмов
СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ИМЕТЬ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ:
о практическом применении в медицине фенотипической и генотипической изменчивости микроорганизмов
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
Работа № 1. Плазмиды. Распространение. Методы выявления
Цель: объяснить причины формирования и распространения лекарственной устойчивости бактерий
Самостоятельная работа: сравнить результаты антибиотикограммы госпитального и внебольничного вариантов золотистого стафилококка (метод бумажных дисков). Результаты внести в таблицу. Сделать заключение о наличии R-плазмид
Дано:
посев стафилококка, выделенного из испражнений (госпитальный вариант)
посев стафилококка, выделенного из зева (внебольничный вариант)
Опыт
Антибиотик |
Диаметр зоны задержки роста |
|
Госпитальный вариант |
Внебольничный вариант |
|
1. Пенициллин |
|
|
2. Ампициллин |
|
|
3. Оксациллин |
|
|
4. Гентамицин
|
|
|
5. Левомицетин
|
|
|
6. Тетрациклин
|
|
|
Результат:_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Вывод:____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Работа № 2. Фенотипическая изменчивость бактерий
Цель: оценить опыт по выявлению фенотипической изменчивости протея, возникшей при действии химических веществ. Зарисовать. Сделать вывод о практическом значении фенотипической изменчивости.
Самостоятельная работа: оценить культуральные свойства протея на МПА и МПА с 0,1% раствором фенола
Посев протея по Шукевичу
МПА МПА + 0.1% р-р фенола (пересев со среды с 0,1 % фенола )
Результат:_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Вывод:____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Работа № 3. Механизмы генетической рекомбинации бактериальной ДНК. Практическое значение.
Цель: разобрать механизм трансдукции (схема).
Самостоятельная работа: учесть результат опыта. Зарисовать. Сделать вывод о практическом значении данного явления
Ход исследования
а) умеренный фаг, полученный при облучении УФ лучами Е. coli лак+ (донор);
б) культура Е. coli лак- (реципиент);
в) среда Эндо, как селективная среда с лактозой для выявления рекомбинантов Е. coli
Получение трансдуцирующего фага
Реципиент E.coli(лак-)
Донор. E.coli (лак+) чистый б/ф
Облучение
рекомбинанты
Фильтрация
МПБ 37°, 40-60 мин.
Ч
К К
истый
бактериофаг
Среда Эндо
Вывод:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Работа № 4. Аттенуация. Живые аттенуированные вакцины
Цель: разобрать принципы получения живых вакцин.
Самостоятельная работа: записать предложенные вакцины с указанием методов аттенуации (см. теоретическую справку)
Название вакцины |
Методы аттенуации |
Оспенная
|
|
Сибиреязвенная СТИ
|
|
БЦЖ
|
|
Туляремийная
|
|
Бруцеллезная
|
|
Чумная E.V.
|
|
Против вируса желтой лихорадки
|
|
Антирабическая
|
|
Гриппозная
|
|
Сыпнотифозная
|
|
Полиомиелитная
|
|
Коревая
|
|
Краснушная
|
|
Паротитная
|
|
Результат:_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Вывод:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ СПРАВКА
к Работе №1
Плазмиды. Методы выявления плазмид.
У бактерий имеется одна замкнутая кольцевая хромосома, содержащая до 4000 отдельных генов, необходимых для поддержания жизнедеятельности и размножения бактерий, т. е. бактериальная клетка гаплоидна, а удвоение хромосомы всегда сопровождается ее делением. Обычная бактериальная хромосома имеет молекулярную массу около 1010Д (5х106 пар оснований; размер генома человека составляет 2,9x109 пар оснований). Длина бактериальной хромосомы в развернутом состоянии, впервые установленная методом радиоавтографии, для клеток E.coli составляет около 1 мм. Возможность регулировать скорость собственного размножения - уникальное свойство бактериального генома.
В некоторых бактериях обнаруживают подвижные молекулы ДНК, представленные транспозонами и инсерционными (вставочными) последовательностями. Они не являются жизненно необходимыми, т. е. не кодируют информацию о синтезе ферментов, участвующих в энергетическом и пластическом метаболизме. Транспозоны и инсерционные последовательности (Is-посл.) связаны с хромосомой и не способны к самостоятельной репликации.
У бактерий обнаружены дополнительные молекулы ДНК - плазмиды.
Плазмиды - фрагменты ДНК с молекулярной массой 106 - 108Д, несущие от 40 до 50 генов, выполняют 2 функции:
регуляторную - компенсация нарушений метаболизма ДНК клетки хозяина. Например, при интегрировании плазмиды в состав поврежденного бактериального генома, не способного к репликации, его функция восстанавливается за счет плазмидного репликона.
кодирующую - внесение в бактериальную клетку новой генетической информации. Например, образованию пилей (F-плазмиды), резистентности к а/б (R-плазмиды), выделению бактериоцинов
Классификация плазмид
Конъюгативные плазмиды относительно крупные F-, R-, Col-плазмиды располагаются автономно, независимо от хромосомы, переносятся от бактерии к бактерии (обычно внутри вида или близкородственными видами) в процессе конъюгации, (чаще выявляются у Гр-палочек).
Неконъюгативные плазмиды небольшие по размерам встроены в бактериальную хромосому характерны для Гр+ кокков, но могут встречаться и у Гр - микроорганизмов. Они не способны к самостоятельной репликации и к переносу из одной клетки в другую
R-плазмиды обусловливают устойчивость к лекарственным препаратам (сульфаниламидам, стрептомицину, пенициллину, тетрациклину) и к тяжелым металлам (ртуть, никель, кадмий, кобальт). R-плазмиды выявляют постановкой чувствительности бактерий к антибиотикам методом диффузии в агар из бумажных дисков.
F-плазмиды контролирует синтез половых ворсинок (sex или F рШ), которые способствуют эффективному спариванию бактерий-доноров с реципиентными клетками при конъюгации. Интегрированные в бактериальную хромосому F-плазмиды называют Hfr-плазмиды (от англ. High frequency of recombitions - высокая частота рекомбинации) - увеличивают «плодовитость» бактерий.
Col-плазмиды контролируют синтез бактериоцинов, способных вызывать гибель бактерий того же вида или близких видов. Бактериоцины обнаружены у кишечной палочки (колицины), бактерий чумы (пестицины), холерных вибрионов (вибриоцины), стафилококков (стафилоцины). Известно более 200 различных бактериоцинов. Роль этих продуктов связана с формированием микробных сообществ.
Способность к синтезу бактериоцинов используют в эпидемиологических исследованиях, выявляя тип колицина, вырабатываемого патогенным видом (колицинотипирование), либо тип плазмиды (колициногенотипирование).
Плазмиды биодеградации несут информацию об утилизации некоторых органических соединений, которые бактерии используют в качестве источников углевода и энергии.
Они могут играть важную роль в экологии патогенных бактерий, обеспечивая им селективные преимущества во время пребывания в объектах окружающей среды и в организме человека. Например, урологические штаммы кишечных палочек содержат плазмиду гидролизации мочевины.
Плазмиды патогенности контролируют вирулентные свойства многих видов, особенно энтеробактерий. К ним относятся плазмиды: ENT, HLY, адгезии, инвазии. В частности Р-Д-,Со1-плазмиды в интегрированном состоянии включают tox+ транспозоны, кодирующие токсинообразование.
Установлено, что гены патогенности входят в состав не только плазмид, но и транспозонов, умеренных бактериофагов, а это определяет широкие адаптационные возможности микроорганизмов. Гены патогенности объединяются в группы сцепления - «острова патогенности». Они детерминируют синтез токсинов, факторов адгезии, инвазии, а также синтез особой транспортной системы III типа, ответственной за доставку факторов патогенности из микроорганизма в эукариотическую клетку.