Модульная единица 2.Физиология и генетика микроорганизмов

ЗАНЯТИЕ 2.1

ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ

Цель занятий: изучить условия и методы культивирования микроорганизмов. Освоить бактериологический метод диагностики.

Студент должен знать:

1. Особенности метаболизма бактерий.

2. Рост и размножение бактерий. Фазы размножения.

3. Питание бактерий.

4. Основные принципы культивирования.

5. Ферменты бактерий. Идентификация бактерий по ферментативной активности.

Студент должен уметь:

■ Применять бактериологический метод диагностики для идентификации бактерий.

Студент должен иметь представление:

о современных методах лабораторной диагностики микроорганизмов.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Работа № 1. Питательные среды

Цель: изучить питательные среды, применяемые в бактериологии и вирусологии

Самостоятельная работа: классифицировать предложенные питательные среды, результаты оформить в виде таблицы (см. теоретическую справку)

среда	происхождение		консистенция			назначение
	естест-венное	искусст-венное	жидкая	полужидкая	плотная	общего	ДДС	элективные
Мясопептон- ныйагар (МПА)
Мясопептон ный бульон (МПБ)
1 % пептонная вода
Среда Эндо
Среды Гисса
Кровяной агар
Молоко
Желточно- солевой агар (ЖСА)
Среда 199

Вывод:

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ СПРАВКА

Работа № 1

Для культивирования бактерий применяют питательные среды. Они могут быть естественными (молоко, морковь, картофель), искусственными (готовят специально). Питательные среды могут быть жидкие и плотные. В зависимости от свойств микробов используют разные среды. Их делят на 3 группы:

1) простые (универсальные) - на них растут только нетребовательные микробы (стафилококки, кишечная палочка). Это МПА и МПБ - мясопептонный агар и бульон.

2) элективные (избирательные) - на них растет только один вид микробов, а другие – нет. Например: 1% щелочная пептонная вода - для холерного вибриона, сахарныйагар - для стрептококка, кровяно-теллуритовыйагар - для дифтерийной палочки и т.д.

3) дифференциально-диагностические - для отличия одного вида от другого по биохимической активности (среды Эндо, Гисса и т.д).

Требования к питательным средам:

- питательность,

- изотоничность,

- буферность, оптимальная рН - 7.2 – 7.4

- стерильность,

- влажность,

- унифицированность в отношении основных компонентов

Питательные среды (состав некоторых питательных сред)

Кровяной агар.Используют для выявления экзотоксина – гемолизина у бактерий. К расплавленному и охлажденному до 45°С МПА (2% агара) стерильно добавляют 5-10% дефибринированной стерильно взятой крови лошади, кролика или барана.

Щелочная пептонная вода.Используют для культивирования холерных вибрионов. Основной раствор пептона: пептона - 100 г, хлорида натрия -50 г, нитрата калия - 1 г, карбоната натрия - 25 г, воды дистиллированной - 1 л; рН 9,0. Стерилизуют при 120°С 20 мин. Для получения пептонной воды основной раствор разводят водой в 10 раз, доводят рН до 8,8 -8,9, стерилизуют.

Мясопептонный агар (МПА).Применяют для выращивания большинства бактерий. К готовому МПБ добавляют 2% агар и оставляют для набухания 30 мин. Кипятят до полного растворения агара. Стерилизуют 30 мин при 120°С.

Желточно - солевой агар (ЖСА).Среда позволяет дифференцировать стафилококки, продуцирующие лецитиназу, от стафилококков, не выделяющих данный фермент, по образованию зон помутнения с перламутровым оттенком вокруг колоний. Среда содержит повышенные концентрации хлорида натрия (8-10%), которые не препятствуют размножению стафилококков, что обеспечивает элективность среды. Готовят среду из питательного солевого агара. В расплавленный и остуженный до 45 ⁰С агар добавляется куриный желток.

Среда 199.Используют для выращивания культур клеток. Синтетическая среда, содержащая аминокислоты, витамины, глюкозу, минеральные соли. Среду используют с добавлением 5-10% коровьей или лошадиной сыворотки.

Дифференциально-диагностические среды.

1. Пс для культивирования и изучения биохимических свойств.

1.1. Среды Эндо, Левина, Плоскирева. Используют как дифференциально-диагностические элективные среды для культивирования бактерий кишечной группы (содержит лактозу). Микроорганизмы, ферментирующие находящийся в этих средах молочный сахар (лактозу) образуют окрашенные колонии - лактозоположительные (колонии красного цвета с металлическим блеском или без блеска). Колонии микробов, не ферментирующие лактозу, бесцветные - лактозонегативные – нежно-розовые, прозрачные, пропускающие свет.

К 100 мл МПА (рН 7,6) при температуре 70°С стерильно добавляют 5 мл 20% раствора лактозы и смесь 0,5 мл насыщенного раствора основного фуксина с 1,25 мл свежеприготовленного раствора сульфата натрия.

1.2.Среды с крахмалом определяют микроорганизмы, образующие амилазу. Об этом узнают, прибавив к культуре несколько капель раствора Люголя, - цвет среды не изменяется. Нерасщепленный крахмал дает с этим раствором синее окрашивание.

1.3.Молоко. При росте микроорганизмов, сбраживающих лактозу, свертывается.

2. Коммерческие наборы – для изучения биохимических свойств (определение набора ферментов микроорганизмов для их идентификации).

2.1. Микротесты - системы (МТС). Они представляют собой полистироловые пластины с лунками, в которых содержатся стерильные дифференциально-диагностические среды.

2.2.Системы индикаторные бумажные (СИБ) - дифференциально-диагностические среды на фильтровальной бумаге.

1. Для культивирования и дифференциации анаэробных микроорганизмов: среда Вильсон-Блера. Готовят из мясо-пептонногоагара, к которому добавляют глюкозу, Na₂S0₃, хлорид железо FeCl₂. На этой среде возбудитель газовой гангрены образует почернение и разрыв агара. Рост происходит в глубине агара. При этом осуществляется восстановление Na₂S0₃ в Na₂S (сульфит натрия), который соединяясь с хлоридом железа, образует сульфат железа черного цвета. Разрыв питательной среды связан с газообразованием.