Определение клональности (разнообразия) т-лимфоцитов

Как известно, удивительное разнообразие ТКР, необходимое для возможности ответа на любой потенциальный антиген, презентированный в рамках совокупности молекул гистосовместимости I и II типов, генерируется как продукт случайной рекомбинации вариабельных (v), соединительных (j) и генов разнообразия (d), а также вследствие случайных вставок/делеций нуклеотидов в процессе такой рекомбинации. В вариабельной области ТКР выявлены гипервариабельные области (CDR1, 2 и 3). По данным рентгеноструктурного анализа, именно CDR3 наиболее тесно физически взаимодействует с антигеном, что определяет результат «распознавания» и его последствия (активация, ответ). Таким образом, анализ формирования ТКР и CDR3, в частности, позволяет оценить как общую способность Т клеток реагировать на антигены, так и особенности ответа на конкретные антигены (при злокачественном росте, инфекциях, аллергии, аутоиммунных заболеваниях и т. д.). Подобные закономерности имеют важное фундаментальное и практическое (диагностика, разработка вакцин, методов адаптивной иммунотерапии) значение. Методически оценить строение ТКР можно:

1. фенотипически: существует ограниченное количество моноклональных антител к продуктам генов, составляющих вариабельные области ТКР. Зарегистрировать взаимодействие меченых антител с Т-клетками способна проточная цитометрия;

2. генотипически: из Т-клеток выделяют РНК, с помощью обратной транскрипции с праймером для константной области ТКР получают кДНК вариабельной области всех ТКР. Далее, с помощью ПЦР с праймерами для всех вариабельных генов (с флуорохромной меткой) и одним праймером для константной части ТКР, получают множество продуктов с различной длиной (из-за вставок и делеций). Затем проводят разгонку в полиакриламидном геле и автоматический учет с анализом по метке и длине продукта (спектротипирование). Полученные совокупности продуктов для каждого вариабельного гена обычно распределяются случайным образом (Гауссово распределение). Накопление лимфоцитов какого-либо клона приводит к заметному смещению распределения для конкретных вариабельных генов. Гораздо лучшие результаты для анализа конкретного ответа на антиген приносит сочетание метода тетрамеров для выделения Т-лимфоцитов, специфичных к конкретному антигену, со спектротипированием. Этот подход позволяет идентифицировать отдельные вариабельные гены и их модификации (путем секвенирования), критически важные для формирования протективного (патологического) иммунного ответа.

Методы оценки функции т-лимфоцитов in vivo

К методам оценки функции Т-лимфоцитов in vivo относятся внутрикожные тесты с анамнестическими антигенами (туберкулином, кандидином, антигенами трихофитонов, E. coli, P. vulgaris и др.). Они выполняются следующим образом: кожу обследуемого в области верхней трети предплечья обрабатывают антисептиком и строго внутрикожно вводят необходимую дозу очищенного антигена (взрослым — 5 ед. туберкулина, детям — 2 ед.) в объеме 0,1 мл. Учет теста проводят через 48–72 ч: измеряют диаметр зоны инфильтрации (папулу) в месте инъекции.

Нормальные результаты свидетельствуют об эффективной работе Т-клеточного звена иммунитета. Одновременная постановка тестов с несколькими анамнестическими антигенами более надежна при выявлении недостаточности клеточного иммунитета (гипо- или ареактивность к одному антигену часто объясняются естественными причинами).

Модифицированные внутрикожные тесты: вместе с антигеном вводится иммуномодулирующий препарат или активатор/ингибитор известных сигнальных путей активации иммунных клеток. По результатам судят об уровне нарушения и возможной эффективности иммуномодуляторов для его коррекции.

Прик-тесты с анамнестическими антигенами. В настоящее время вместо внутрикожных тестов, постановка которых сравнительно трудоемка, требует определенной квалификации и болезненна для пациентов, все чаще применяют прик-тесты с анамнестическими антигенами. Прик-тесты особенно эффективны при постановке тестов с несколькими анамнестическими антигенами (до 5 разных антигенов + контроль). К преимуществам этого метода следует отнести большую стандартность и воспроизводимость. К недостаткам — меньшее количество антигена/введение.

Иммунизация аллергенами, вызывающими ГЗТ. В качестве подобного вещества использовали ДНХБ. После иммунизации проводят разрешение (накожная аппликация) и измерение интенсивности ГЗТ (степень инфильтрации). В настоящее время не применяется.

Проведение бустерных иммунизаций против анамнестических антигенов (АДСМ, АДМ, АСМ) и определение возрастания титров антител. Значительный прирост специфических антител доказывает нормальную функцию клеток АПК, Т- и В-лимфоцитов.

МЕТОДЫ ОЦЕНКИ КОЛИЧЕСТВА И ФУНКЦИИ В-ЛИМФОЦИТОВ

Содержание В-лимфоцитов оценивают путем определения процента клеток, несущих на поверхности В-клеточные маркеры (CD19, 20, 24, 72 и др.) методом проточной цитофлуориметрии (см. рис. 6–9). Далее можно рассчитать количественные показатели, основываясь на количестве лейкоцитов крови и общем содержании лимфоцитов.

Историческое значение имеют методы, основанные на феномене розеткообразования с эритроцитами мыши (М-розетки), ЕАС-розетко-образования (использование связывания В-клеток с комплексами «эритроцит–антитело–комплемент» за счет Fc-рецепторов и рецепторов к факторам системы комплемента (CD21)).

Функцию В-клеток обычно оценивают по феномену антителообразования:

1. обнаружение «естественных» антител: изогемагглютинины групп крови, гетерофильные антитела (направленные против эритроцитов барана, кролика и др. животных), антистрептолизин и бактерицидные антитела против E. coli;

2. оценка гуморального ответа на обычную иммунизацию:

а) для неиммунизированных детей можно использовать коммерческую дифтерийно-столбнячную вакцину в рекомендуемых дозах. Через 2 недели после иммунизации в крови определяют противодифтерийные и/или противостолбнячные антитела;

б) пациентам, иммунизированным вакцинами дифтерии/столбняка или дифтерии/коклюша/столбняка, проводят одну ревакцинацию, затем определяют концентрацию антител;

в) для оценки гуморального ответа на углеводные антигены следует применять пневмококковые или менингококковые полисахариды или свободный от белков полисахарид Hemophilus b. Интерпретация результатов иммунизации полисахаридными антигенами у детей младше 5 лет затруднена.

Определение количества иммуноглобулинов в сыворотке крови является наиболее применяемым методом оценки функции В-лимфоцитов. Для этого обычно применяют метод радиальной простой иммунодиффузии в геле по Манчини, иммунонефелометрию и ИФА.

Простая радиальная иммунодиффузия в геле по Манчини (рис. 16) выполняется следующим образом: антитела к антителам человека (отдельным классам, субклассам) вносятся в гель. В геле вырезают лунки и заполняют их разведенными образцами сывороток пациентов. Отдельно раскапывают разведения стандартной сыворотки для построения калибровочной кривой. Антитела из сыворотки диффундируют в гель и взаимодействуют с антителами против Ig человека. В зоне эквивалентности выпадает линия преципитации. Далее пластина геля отмывается от несвязавшихся реагентов и мелких иммунных комплексов и окрашивается на белок. Очевидно, что размер зоны эквивалентности будет прямо пропорционален концентрации антител в пробе и обратно пропорционален концентрации антител против Ig человека в геле. Эта закономерность «привязывается» к конкретным условиям постановки с помощью построения калибровочной кривой. Далее проводят измерение диаметров колец образцов пациентов и рассчитывают концентрацию антител в сыворотке графическим методом или по формуле (определяется с применением регрессионного анализа диаметров колец стандартных разведений). Предел определения составляет ~5–10 мг/л.

Иммунонефелометрия — это метод, позволяющий измерить концентрацию антигена посредством его взаимодействия с антителами, образования иммунных комплексов и изменения оптических характеристик среды (рис. 17). Изменение мутности среды пропорционально боковому рассеянию света при прохождении луча лазера сквозь суспензию, содержащую иммунные комплексы. Измерение проводят с помощью спектрофотометра при длине волны 340–360 нм. Концентрацию антигена определяют с помощью калибровочной кривой. Метод широко применяется иммунологическими лабораториями при измерении концентрации компонентов комплемента и иммуноглобулинов в сыворотке крови или биолог ических материалах больных.

Рис. 16. Определение количества иммуноглобулинов крови по Манчини

Р ис. 17. Определение иммуноглобулинов крови методом иммунонефелометрии

ИФА ставится по обычной схеме. Позволяет определять общее количество иммуноглобулинов крови, количество Ig основных классов, субклассов и, в случае необходимости, количество специфических Ig

При дефиците антител в сыворотке крови для уточнения характера и механизма недостаточности применяют следующие методы:

1. Оценка количества антителообразующих клеток (АОК). Сперва выделяют мононуклеары периферической крови пациента. Клетки культивируют с В-клеточными митогенами или активаторами (митоген лаконоса, ЛПС и др.) в течение 7 дней. Далее визуализируют АОК с помощью обратного гемолитического бляшкообразования. Культивированные клетки смешивают с эритроцитами барана, нагруженными белком А стафилококка. На данном этапе секретируемые антитела связываются с эритроцитами своими Fc-фрагментами через белок А вне зависимости от специфичности. Далее вносят антитела против антител человека и комплемент. В результате образуются иммунные комплексы, связанные с поверхностью эритроцита. Происходит активация комплемента и лизис эритроцитов вокруг плазмацита, секретирующего антитела. Зоны гемолиза подсчитывают под микроскопом и выражают как процент АОК от всех мононуклеаров. Для этой цели применим метод элиспот (см. выше).

2. Оценка количества синтезированных антител — определение количества образованных антител в супернатанте (как общих, так и специфических, в т. ч. и отдельных классов, например, IgE) можно проводить методом твердофазного ИФА по стандартной схеме.

КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДОВ ОЦЕНКИ КОЛИЧЕСТВА И ФУНКЦИИ Т- И В-ЛИМФОЦИТОВ

Проблемы, связанные с оценкой функции Т-клеток человека. Методы, разработанные для оценки функции лимфоцитов человека, имеют важные ограничения:

1. Большинство исследований проводят in vitro. Таким образом, все методы основываются на или воспроизводят известные in vivo феномены, или, по крайней мере, определяются клетки, активирующиеся in vivo.

2. Следует иметь в виду ограниченность современных познаний и методов в иммунологии. Например, отождествление клеток, позитивных по маркеру CD8, с Т-супрессорами или, напротив, оценка активации лимфоцитов периферической крови по CD25 маркеру (экспрессия альфа-цепи рецептора ИЛ2 действительно связана с определенными этапами активации лимфоцитов) привели к ошибочным заключениям об общей иммунореактивности из-за недооценки содержания в крови соответственно Т-киллеров (особенно при вирусных инфекциях) и CD4+CD25+ клеток, поддерживающих периферическую толерантность.

3. Манипуляции с лимфоцитами приводят к многочисленным трудно учитываемым погрешностям (механические повреждения, адгезия к посуде, состав среды (особенно содержание биоактивных веществ, например, ЛПС), изменение состава клеток при культивировании и др.).

4. Часто единственным источником клеток является кровь, содержащая циркулирующие лимфоциты; их состав и, особенно, состав АПК существенно отличается от того, что наблюдается в лимфоидной ткани или в месте реализации иммунных реакций. Тем не менее, существуют методы забора и анализа реакций локального иммунитета (биопсийный материал, смывы со слизистых, слюна, моча и др. материалы).

5. Изменения в количественных и функциональных параметрах лимфоцитов и закономерности, их описывающие, как правило, носят статистический характер (т. е. воспроизводимо выявляются только на больших группах пациентов при сравнении со средними величинами практически здоровых контролей). Таким образом, выявленные изменения у конкретных пациентов зачастую находятся в пределах физиологической нормы и не поддаются интерпретации.

Т-клеточный ответ как суррогатный маркер в клинике. Разработка новых методов иммунотерапии для лечения инфекционных, аутоиммунных, аллергических, онкологических и др. заболеваний требует введения в протоколы испытания и лечения тестов для оценки количества/функции лимфоцитов.

Очевидно, что при некоторых заболеваниях, количество и/или функция лимфоцитов может служить суррогатным критерием прогноза, диагностики, эффективности лечения, подобно количеству специфических антител и их возможного протективного эффекта (при испытаниях вакцин или оценке эффекта вакцинации).

В частности, клеточный иммунный ответ имеет важное патогенетическое значение при вирусных инфекциях (корь, ЦМВ, ВИЧ, ЭБВ, ветряная оспа и др.), трансплантации, развитии злокачественных новообразований. Обнаружение или количественный анализ специфических киллеров, а также цитокинового профиля специфических хелперов в крови и тканях, активности и состава АПК в тканях или регионарных лимфоузлах могут коррелировать с исходом заболевания, и служить критерием для прогноза и мониторинга.

Распространение и популяризация знаний об иммунологии и иммунной системе, а также включение иммунологических концепций в теории патогенеза большинства заболеваний стали причиной разработки методов диагностики «иммунопатологии» и соответствующих методов «иммунокоррекции». Было предложено значительное количество методов интерпретации иммунологических показателей, множество иммунотропных препаратов и схем их применения при самой различной патологии. Иммунотропные препараты применялись в ряде случаев как пищевые добавки или витамины: без показаний, мониторинга изменений в организме и критериев эффективности и отмены. Ситуация отчасти смягчается слабостью или отсутствием эффекта от многих препаратов.

В настоящее время большинство иммунологов осознают бесперспективность попыток применения количественных и неспецифических функциональных тестов для построения теории патогенеза, диагностики «иммунодефицита» и/или назначения иммунотропной терапии при состояниях, связанных с разнообразными неспецифическими воспалительными процессами (чаще хроническими), повышенной болезненностью, «оптимизации» лечения гнойно-воспалительных заболеваний различной локализации (дыхательного, желудочно-кишечного и мочеполового трактов, кожи и т. д.) и некоторых болезней внутренних органов, а также новообразований. Разумной альтернативой является применение арсенала иммунологических методов к исследованию локального и, особенно, специфического иммунитета.

Следует отметить, что в последние годы появились основания для разработки более специфических тестов, что связано с возникновением новых технологий получения специфических антигенов (тетрамеры, дендритные клетки + антиген, синтетические, рекомбинантные или высокоочищенные препараты антигенов), а также с приходом в рутинную практику высокотехнологических методов регистрации и анализа (проточная цитометрия и др.). Тем не менее, практическое применение методов оценки количества и функции Т- и В-клеток чаще всего оправдано при сравнительно узком спектре медицинских задач:

1. первичных иммунодефицитах;

2. опухолях иммунной системы;

3. ВИЧ-инфекции;

4. трансплантологии;

5. мониторинге иммунного статуса при длительном применении иммунодепрессантов.

В качестве примера рассмотрим возможности применения анализа клеточного иммунного ответа при трансплантации. Для определения состояния активации иммунной системы и прогноза развития реакции отторжения, как правило, применяют антигенспецифические тесты с лимфоцитами донора (активированными В-лимфоцитами, которые заготавливаются заранее и хранятся до использования). К данным тестам относятся:

• СКЛ;

• цитотоксические тесты;

• элиспот для определения продукции ИФН-гамма, ИЛ10 и др.;

• внутриклеточное определение цитокинов;

• тетрамеры;

• постановку транс-vivo ГЗТ тестов.

В некоторых случаях «специфичность» тестам придает характер материала: определение в моче перфоринов, гранзимов или их мРНК.

Для этих же целей применяют и некоторые антигеннеспецифические тесты: РБТЛ на фитогемагглютинин, иммунофенотипирование (определение Т-регуляторов), определение мРНК перфоринов, гранзимов или мРНК транскрипционных факторов FOXP3 или T-bet, иммуноспектротипирование.