1. Колориметрические методы: км метили различными красителями, которые освобождались при лизисе и окрашивали супернатант.

2. Чувствительный метод на основе флуориметрии с временным разрешением: КМ метили соединениями редкоземельных металлов. По освобождении в результате лизиса они образовывали устойчивые, интенсивно флуоресцирующие соединения. Таким образом можно учесть даже незначительное проявление цитотоксической активности.

3. Изящный метод, основанный на апоптическом изменении КМ при их лизисе ЦТЛ: КМ метят радиоактивным тимидином (встраивается в ДНК) и далее подвергают лизису ЦТЛ. Вследствие апоптоза ДНК КМ фрагментируется и не задерживается на фильтрах при сборе клеток из реакционных лунок. Таким образом, отсутствие радиоактивности фильтров свидетельствует о цитотоксической активности лимфоцитов.

Определение активности CD8⁺ T-клеток методом Элиспот. Определение продукции цитокинов CD8⁺ T клетками рассматривается как альтернатива цитотоксическим тестам. В частности, определение ИФН-гамма и/или ФНО-альфа методом Элиспот дает сравнимые результаты с классическим цитотоксическим тестом с радиоактивным хромом. При этом для активации CD8⁺ клеток используют короткие синтетические пептиды, которые распознаются ЦТЛ. Элиспот дает информацию о количестве CD8⁺ T-клеток, секретирующих ИФН-гамма и/или ФНО-альфа, и обладает большей чувствительностью при исследовании отдельных малочисленных субпопуляций лимфоцитов.

П рименение технологии тетрамеров для прямой визуализации специфических Т-лимфоцитов (CD8⁺ ЦТЛ). Данная технология (рис. 13) способна идентифицировать индивидуальные клетки, специфические к антигену в контексте молекул ГКГС 1-го типа. Вкратце, соответствующая молекула ГКГС 1-го типа синтезируется E. coli в растворимой форме, причем на ее карбоксильном конце встраивается последовательность для присоединения биотина. Далее к ней добавляется бета-2-микроглобулин (бета-цепь молекулы ГКГС 1-го типа) и соответствующий олигопептид-антиген. После этого к молекуле «пришивается» биотин (с помощью фермента Bir-A). При добавлении меченного флуорохромом авидина (который имеет четыре участка для связывания биотина) образуется тетрамерный комплекс. Такой комплекс обладает гораздо большей аффинностью к ТКР CD8+ ЦТЛ (CD4+ Th) и может быть выявлен с помощью проточной цитометрии. Подобная техника была использована при исследовании иммунного ответа при ЭБВ и ВИЧ-инфекции у человека.

Р

Последовательность для фермента BirA

ис. 13. Оценка количества антигенспецифических CD8+ цитотоксических Т-лимфо-цитов методом тетрамеров

К сожалению, данная технология применима только в случае предварительного определения олигопептида, на который идет ответ и соответствующей молекулы ГКГС 1-го типа, в составе которой он презентируется.

К преимуществам технологии следует отнести ее практичность, скорость, возможность применения иммунофенотипирования, сортировки клеток и т. д.

Методы определения функции тимуса

Долгое время функцию тимуса определяли по макро- или микроморфологии: по объему и характеру тени на рентгенограмме или по результатам биопсии органа (отсутствие телец Гассаля, четкой границы между зонами тимуса, резкое снижение количества тимоцитов, скопления ретикулоэндотелиальных клеток, увеличение доли жировых клеток).

В настоящее время разработаны методы оценки функции тимуса на основе количественного определения эксцизионных кольцевых ДНК, образующихся при рекомбинации цепей ТКР лимфоцитов в тимусе (рис. 14). Напомним, что события онтогенеза Т-лимфоцитов происходят в следующей последовательности: миграция тимических предшественников в тимус; интенсивное размножение их в коре тимуса, рекомбинация дельта-цепи — рекомбинация гамма-цепи, либо рекомбинация бета-цепи — рекомбинация альфа-цепи, положительная и, по завершению рекомбинации, отрицательная селекция; дифференцировка и выход из тимуса. Таким образом, делеция генов дельта-цепи определяет количественные и качественные характеристики образования лимфоцитов с альфа-бета-цепей ТКР, которые составляют основную массу лимфоцитов у человека.

Рис. 14. Оценка функции тимуса на основе определения эксцизионных колец в Т-лим-фоцитах

Эксцизионная ДНК, появляющаяся при делеции генов дельта-цепи ТКР, стабильна, не реплицируется при размножении лимфоцитов и долго сохраняется в процессе онтогенеза. Понятно, что количество такой ДНК постоянно уменьшается для данной популяции пре-тимоцитов вследствие их размножения в ходе положительной селекции, гибели клеток при отрицательной селекции, апоптоза наивных лимфоцитов, не нашедших «своего» антигена, размножении лимфоцитов в ходе иммунного ответа и т. д. Методически количественное определение эксцизионной ДНК решается с помощью ПЦР. На рис. 15 показано возрастное экспоненциальное снижение функции тимуса у здоровых лиц. Необходимо отметить, что функция тимуса может значительно возрастать (компенсаторно) при необходимости восполнения популяции Т-клеток (например, при ВИЧ-инфекции). В настоящее время проводятся интенсивные исследования возможности управления тимусом с помощью гормональных, циток иновых и других стимулов.

Рис. 15. Динамика функции тимуса на основе определения эксцизионной ДНК