Методы определения функции т-лимфоцитов

Функцию Т-лимфоцитов периферической крови можно упрощенно представить в виде последовательности следующих этапов:

1. активация наивных лимфоцитов под воздействием презентированного антигена (Т-лимфоциты не распознают нативные антигены):

• изменение потенциала мембраны и содержания внутриклеточных электролитов;

• активация сигнальных механизмов;

• активация транскрипционных факторов;

• изменение активности генов;

• изменение экспрессии поверхностных рецепторов;

• появление рецепторов к цитокинам;

• синтез и секреция цитокинов;

• пролиферация, дифференцировка и распределение по тканям;

2. активация под воздействием презентированного антигена праймированных лимфоцитов с выполнением функции:

• синтеза и секреции цитокинов;

• цитолиза.

Следует отметить, что лимфоциты периферической крови представлены клетками, прошедшими антигеннезависимую дифференцировку (на пути в периферические органы иммунной системы), — большая часть, и клетками, прошедшими антигенспецифическую дифференцировку (рециркулирующие), — малая часть.

При активации эти пулы будут вести себя по-разному — в соответствии со своими функциями:

• первые активно выделяют ростовые цитокины и пролиферируют;

• вторые выделяют эффекторные и иммунорегулирующие цитокины, которые могут вызвать апоптоз лимфоцитов, угнетение или стимуляцию процессов активации и пролиферации наивных лимфоцитов, угнетение или стимуляцию присутствующих АПК (процессинг и презентация антигенов, костимуляторные сигналы, иммунорегулирующие цитокины).

Следует учитывать, что наивные и эффекторные лимфоциты также неоднородны. Как при ответе на специфический антиген, так и при стимуляции митогенами, прямо активируются лишь некоторые клетки. Остальные — большая часть — активируются под их влиянием. Эта пассивная «серая» масса может усиливать определяемый феномен (функцию), ослаблять или не изменять.

Необходимо отметить, что любые отклонения от стандартного протокола и применение сомнительных реагентов способны непредсказуемым образом изменить результаты тестов. Это касается, в первую очередь, содержания ЛПС в растворах, средах и посуде, свойств культуральной и лабораторной посуды (контактная активация, адгезия и потери отдельных субпопуляций), особенностей протокола (процедура выделения клеток, закладки культур) и т. д.

Оценка пролиферативной активности лимфоцитов (РБТЛ) на различные стимулы является фундаментальным тестом для оценки функции лимфоцитов.

Основной вариант (рис. 9): лимфоциты выделяют методом градиентного центрифугирования или используют цельную кровь с цитратом натрия или гепарином. Клетки культивируют в присутствии митогенных² (фитогемагглютинин, конканавалин) или антигенных³ стимулов в течение 3–7 дней. Далее добавляют тимидин, меченный тритием, на 6–18 ч. После этого клетки собирают, отмывают от среды, лизируют и измеряют радиоактивность суммарной ДНК.

Рис. 9. Основной вариант лимфопролиферативного теста (РБТЛ)

В некоторых случаях клетки культивируют с разными концентрациями стимуляторов. Все опыты сопровождаются контролями (спонтанная пролиферативная активность). Результат обычно выражают в виде индекса стимуляции: отношения радиоактивности ДНК клеток в присутствии стимулятора к радиоактивности ДНК клеток без стимулятора. Метод широко применяется, включение метки в ДНК хорошо коррелирует с митотической активностью лимфоцитов, а она, в свою очередь, — с количеством специфических (или способных к пролиферации) клеток. Тем не менее, в некоторых случаях количество последних может быть менее необходимого для регистрации результата. Кроме того, результат сильно подвержен погрешностям при выделении клеток, закладке культуры и манипуляциях с ней. Считается, что вариант с цельной кровью более физиологичен и дает более адекватные результаты. Широкое распространение метода ограничено необходимостью работы с радиоактивными изотопами в соответствующих условиях.

Другие варианты постановки РБТЛ отличаются, в основном, способом учета пролиферативного теста:

1. по содержанию бластных клеток в популяции лимфоцитов после стимуляции. Готовят мазки, окрашивают и подсчитывают процент бластов ко всем клеткам (на 200–400 клеток). Метод хорошо определяет активацию лимфоцитов, однако является трудоемким и субъективным;

2. биохимической активности клеток: в культуру добавляют реагенты, изменяющие цвет при биологической трансформации. Например, нитросиний тетразолий преобразуется клетками в черный (синий) нерастворимый в воде формазан. После окончания культивирования клетки отмывают, лизируют. Гранулы красителя растворяют в изопропиловом спирте (или ДМСО) и измеряют оптическую плотность раствора. Метод отражает количество и степень активации лимфоцитов, легко адаптируется для учета на планшетных фотометрах.

Метод предельных разведений. Для получения информации о количестве клеток, специфических к конкретному антигену, применяют метод лимитирующих (предельных) разведений (рис. 10). Положительный результат теста (пролиферация культуры) свидетельствует о присутствии специфических клеток на старте культивирования и характеризует их пролиферацию в ходе культивирования. В дальнейшем функция этих клеток может быть исследована в цитотоксических тестах или по продукции цитокинов. На первоначальном этапе закладываются микрокультуры лимфоцитов в убывающих разведениях (по 24 культуры на каждое разведение; объем ~20 мкл). Ростовые, питательные, стимулирующие факторы берутся в избытке, так что единственным лимитирующим фактором для роста клеток остается число клеток, специфических к антигену. В этих условиях количество отрицательных культур соответствует распределению Пуассона. Статистические законы позволяют рассчитать исходное число клеток, содержащее одну антигенспецифическую клетку. Далее легко оценить процент специфических клеток в исходной популяции.

Рис. 10. Метод предельных разведений

Подобный принцип легко адаптировать для оценки:

1. специфических Т-хелперов: вместо пролиферативной активности можно регистрировать наличие/отсутствие какого-либо цитокина в супернатанте культуры с помощью ИФА;

2. специфических Т-киллеров: регистрируют наличие клеток, проявляющих цитотоксическую активность против аутологических клеток, инфицированных вирусами (ЦМВ, герпес).

МПР является более информативным и быстрым, чем классический пролиферативный тест, однако требует значительного количества клеток (50 мл крови), трудоемок и зачастую сложен в интерпретации.

Таким образом, лимфопролиферативный тест полезен для мониторинга иммунного ответа. Он сравнительно доступен и позволяет обрабатывать одновременно значительные количества образцов. Однако отсутствие сведений о характере процессов и количестве реагирующих клеток не позволяет интерпретировать результаты теста, иначе чем общая реактивность лимфоцитов. МПР может дать количественную характеристику иммунному ответу, однако почти не применяется в рутинной практике.

Оценка продукции цитокинов Т-клетками. Цитокины осуществляют дистантные взаимодействия клеток иммунной системы и организма в норме и при патологии. Их определение нашло применение при диагностике локальных и системных воспалительных процессов (инфекции, новообразования, трансплантация, иммунодефициты и др.).

Открытие типов иммунного ответа (Th1, Th2, Th3, Th17 и т. д.) привело к переоценке значимости определения продукции цитокинов, а точнее, определению цитокинового профиля ИКК при различной иммунопатологии.

Цитокины можно непосредственно выявлять в крови пациентов либо лимфоциты могут быть выделены, культивированы и стимулированы in vitro. В обоих случаях возможно использование биологических или иммунных методов. Иммунологические методы применяются шире, поскольку являются быстрыми, стандартными и более доступными. Биологические методы определяют биологическую активность цитокинов, таким образом выявляются лишь функционально активные цитокины. Кроме того, в сыворотке крови или супернатантах культур присутствуют различные цитокины в разном количестве. Биологические объекты (линии клеток) часто недостаточно специфичны для определения активности только одного цитокина.

Биологические методы определения цитокинов. Классические биологические методы определения цитокинов основываются на выявлении влияния цитокина на чувствительные клетки: пролиферации, дифференцировке, усилении цитотоксичности, синтезе цитокинов или других веществ. В качестве примера рассмотрим определение ИЛ1 с помощью культуры тимоцитов мыши.

Для определения пригодны тимоциты мышей линии СН3/HeJ, нечувствительные к ЛПС. В лунки планшета добавляют исследуемый материал и контроли (обычно несколько разведений), митоген в малой дозе и одинаковое количество тимоцитов. Инкубируют 48 ч при 37 ºС и учитывают пролиферацию любым удобным методом. Сравнивая контрольные и опытные результаты, рассчитывают содержание ИЛ1 в материале.

Новые методы биоанализа основаны на создании линий клеток, отвечающих на один цитокин, причем таким образом, чтобы был возможен количественный учет традиционными методами (фотометрически). Например, ИЛ10 можно определять с помощью линии мышиных В-лимфо-цитов, в которые введен ген рецептора человеческого ИЛ10. Вкратце, в лунки планшета добавляют равное количество клеток культуры и красителя для учета пролиферации по биохимической активности. Часть лунок используют для получения калибровочной кривой (добавляя рекомбинантный ИЛ10 в известной концентрации), остальные — для определения ИЛ10 в образцах. После инкубации проводят фотометрию содержимого лунок, строят калибровочную кривую и рассчитывают содержание ИЛ10 в образцах.

Методы определения цитокинов, основанные на применении специфических антител.

Твердофазный иммуноферментный анализ. Наиболее простой метод оценки Th1/Th2-профиля — это культивирование лимфоцитов в присутствии антигена или стимулятора, забор супернатанта и определение индикаторных цитокинов (ИЛ2 или ИФН-гамма — для Th1 и ИЛ4 для Th2) методом сэндвич-ИФА с использованием моноклональных антител к соответствующему цитокину.

Метод сравнительно прост в постановке, однако имеет погрешности, связанные с разбавлением цитокинов в культуральной среде, потреблением их клетками, разрушением их протеазами и связыванием с растворимыми рецепторами.

Элиспот (enzyme-linked immunospot) является модификацией тИФА, позволяющей обнаружить продукцию цитокинов отдельной клеткой (рис. 11). Клетки культивируются на мембранах, вложенных в культуральные планшеты, в течение нескольких суток. Мембрана покрыта антителами к определенному цитокину (цитокинам). После инкубации цитокины, связавшиеся с мембраной в месте продукции, визуализируются с помощью вторых антител, меченных ферментом, и хромогенного субстрата. Клетки, продуцировавшие цитокин, видны как пятна на мембране. Метод в 200 раз чувствительнее тИФА и позволяет получить количественные данные о проценте клеток, производящих цитокин, сравнимые с МПР.

Рис. 11. Применение метода элиспот для оценки количества клеток, секретирующих целевой продукт

Метод не получил широкого распространения вследствие дороговизны, субъективности и трудоемкости (визуальный подсчет пятен различной интенсивности и формы). В настоящее время доступны компьютерные системы учета Элиспот.

Определение внутриклеточных цитокинов. Продукция цитокинов на уровне одного лимфоцита может быть оценена с помощью проточной цитофлуориметрии. Лимфоциты стимулируют in vitro (форболовыми эфирами и иономицином, антигеном, тетрамерами и т. д.), затем добавляют агенты, блокирующие транспорт везикул и секрецию (монензин или брефельдин). Далее клетки фиксируют, пермеабилизируют (повышают проницаемость мембран для проникновения антител внутрь клеток) и окрашивают антителами к цитокинам, меченными флуорохромами.

Важным преимуществом метода является возможность одновременной окраски клеток различными антителами к CD или другим цитокинам, что позволяет получить точные данные о функции лимфоцитов.

Определение цитокинов с помощью выявления мРНК. Предложено несколько методов выявления мРНК:

1. nothern blot анализ;

2. метод блокирования РНКазы;

3. гибридизация in situ;

4. ОТ-ПЦР (ПЦР с обратной транскрипцией);

5. cДНК-эррей.

Однако ни один из них не применяется в рутинной лабораторной практике из-за сложностей с получением и хранением препаратов РНК, высоких требований к оснащению лаборатории, квалификации лаборантов, значительной трудоемкости методов, применения радиоактивных меток и т. д. Указанные методы имеют несколько общих начальных этапов:

1. выделение общей РНК (лизис клеток, осаждение и удаление белков фенолом, удаление фенола и липидов хлороформом, отмывка (переосаждение) препарата нуклеиновых кислот этанолом, растворение, измерение концентрации);

2. выделение мРНК (1–5 % от общей), например, путем гибридизации-элюции с носителем за счет поли-А-хвостов;

3. удаление примесей ДНК (путем обработки препарата ДНК-азами).

Nothern blot анализ. Препарат мРНК разгоняют в денатурирующем полиакриламидном геле, переносят на мембрану, фиксируют. Далее мембрану обрабатывают неспецифическими (случайной последовательности) олигонуклеотидными зондами, комплементарными исследуемой мРНК, меченными радиоактивной меткой (³²Р). Связывание метки визуализируют с помощью авторадиографии. Таким образом, метод позволяет идентифицировать специфическую мРНК по размеру (длине пройденного пути в геле) по сравнению с контролем и оценить ее количество (по интенсивности связывания метки). Метод достаточно длительный, дорогостоящий и трудоемкий.

Метод блокирования РНК-азы. К препарату мРНК (общей РНК) добавляют специфические комплементарные последовательности РНК, меченные ³²Р. При этом образуются димеры (двуцепочечные фрагменты РНК), которые успешно противостоят рибонуклеазе одноцепочечной РНК (рибонуклеаза А). Далее фрагменты разделяют с помощью электрофореза высокого разрешения и визуализируют путем авторадиографии.

Таким образом, метод позволяет обнаружить мРНК искомого вещества (специфическая гибридизация) и оценить ее количество по интенсивности связывания метки. В настоящее время коммерчески доступны наборы для определения различных биологически активных веществ (цитокинов, их рецепторов и др.).

Гибридизация in situ. Метод применяется для оценки количества и расположения (распределения) клеток, производящих цитокины (хемокины) или другие функциональные молекулы (рецепторы, антигены, компоненты сигнальных механизмов и др.) в тканях. Метод включает следующие основные этапы:

1. быстрое приготовление срезов (криосрезы) или фиксация материала (РНК быстро разрушается в тканях);

2. предгибридизационная подготовка (повышение проницаемости клеток для специфических зондов и блокирование неспецифического связывания);

3. гибридизация;

4. промывка среза для удаления несвязавшихся зондов;

5. проявление (визуализация) связавшихся зондов (авторадиография).

Метод длительный, трудоемкий, включает работы с изотопами.

ОТ-ПЦР. Классическая ПЦР позволяет быстро амплифицировать специфическую ДНК и легко ее идентифицировать путем электрофореза, гибридизации или других подходов. Таким образом, для определения мРНК цитокинов, ее сначала нужно переписать в кДНК. Это достигается с помощью этапа обратной транскрипции: общая РНК, обработанная ДНК-азой, смешивается с реакционным буфером, активированными нуклеотидами, праймерами, способными связываться с РНК случайным образом (таким образом достигается переписывание любой РНК, в т. ч. искомой) и обратной транскриптазой. Смесь инкубируется при 37–40 ºС 40–60 мин, после чего ставится обычная ПЦР (качественный анализ) или ПЦР реального времени (количественный анализ) с соответствующими способами визуализации результата.

Метод сравнительно быстрый, высокочувствительный, специфичный. Проведение общих начальных этапов: выделение общей РНК высокого качества, осуществление обратной транскрипции — значительно облегчается благодаря коммерчески доступным наборам. Праймеры для широкого спектра биоактивных веществ производятся рядом фирм или могут быть синтезированы на заказ. Распространение метода сдерживается дороговизной аппаратов для ПЦР реального времени (11 000 $ производства РФ), высокой стоимостью реагентов и требованиями к квалификации сотрудников.

Определение экспрессии маркеров активации. Активацию лимфоцитов можно оценить путем измерения экспрессии поверхностных маркеров активации с помощью проточной цитофлуориметрии. Для такого исследования определяют: CD25, CD69, CD71 и HLA-DR — молекулы, экспрессия которых повышается при активации Т-лимфоцитов. Данный подход позволяет одновременно определять и маркеры субпопуляционной принадлежности лимфоцитов, что значительно расширяет возможности для анализа функции ИКК. Однако корреляция результатов пролиферативных и морфофункциональных тестов неоднозначна.

Определение цитотоксичности Т-лимфоцитов. ЦТЛ играют важную роль при ответе на вирусные инфекции и злокачественные опухоли. ЦТЛ — это CD8⁺ лимфоциты, что подтверждается их способностью распознавать антиген в контексте молекул ГКГС 1-го типа (внутриклеточные антигены). Однако имеются данные о цитотоксической активности CD4⁺ лимфоцитов у людей и животных. Более того, они имеют определяющее значение при некоторых инфекциях, например, ВПГЧ-2.

Основной проблемой оценки цитотоксической активности Т-лимфо-цитов человека является отсутствие клеток-мишеней, экспрессирующих антигены ГКГС больного. Наиболее простой способ решения проблемы — однонаправленная смешанная культура лимфоцитов (СКЛ).

Сначала выделяют лимфоциты больного и донора (линия Т-лимфо-цитов). Клетки донора обрабатывают митомицином С (противоопухолевый антибиотик, останавливающий синтез ДНК) для прекращения пролиферации. Лимфоциты смешивают и культивируют 7–9 дней. При этом образуются цитотоксические лимфоциты, специфичные к аллогенным антигенам ГКГС. Далее с выросшими клетками ставят цитотоксический тест, используя в качестве мишеней лимфоциты того же донора (линии) с соответствующей меткой (см. ниже). Следует иметь в виду, что таким образом тестируется только цитотоксический потенциал лимфоцитов; этапы процессинга, презентации, костимуляции и т. д. напоминают трансплантационную реакцию и не отражают механизмы противовирусного, противобактериального или противоопухолевого иммунитета.

Цитотоксический тест с радиоактивным хромом. Этот классический тест предусматривает пометку клеток-мишеней хроматом натрия (Na₂⁵¹CrO₄). Далее клетки-мишени инкубируются с ЦТЛ, причем различают краткосрочные (4–6 ч) и долгосрочные (18–24 ч) тесты. Количество радиоактивного хрома в супернатанте пропорционально лизису клеток-мишеней. Хром изменяет валентность (с 6 до 3) в клетках-мишенях и не м ожет включаться в новые клетки.

Рис. 12. Определение цитотоксической активности лимфоцитов с радиоактивным хромом

С помощью МПР удалось установить, что одна ЦТЛ может лизировать до пяти КМ, а для обнаружения эффекта необходимо соотношение ЦТЛ–КМ не менее 1 : 1000. К сожалению, в обычных случаях (периферическая кровь) частота специфических ЦТЛ значительно ниже и цитотоксическая активность не выявляется. Исключение представляют вирусные инфекции, такие как корь, ЦМВ, ЭБВ, эпидемический паротит и ВИЧ-инфекция. Таким образом, клетки крови следует культивировать, стимулируя специфическим антигеном, не менее 2 недель, прежде чем ставить цитотоксический тест. Учитывая рестрикцию ответа ЦТЛ по ГКГС, требуется организовать аутологические АПК, презентирующие антиген по цитоплазматическому пути, что представляет значительные трудности. В противном случае ответа не будет вообще (он разовьется на гетерологические АПК) или образуются CD4+ хелперы.

В целом, цитотоксический тест с радиоактивным хромом является трудоемким, требует большого количества клеток (50–100 мл крови), позволяет получить полуколичественные результаты о содержании в материале специфических клеток-предшественников ЦТЛ к исследуемому антигену.

Альтернативные методы. Вследствие неудобства работы с радиоактивным хромом были предложены: