Методы определения количества т-лимфоцитов

Для определения количества Т-лимфоцитов используются следующие методы:

I. Методы розеткообразования:

1. Реакция розеткообразования с эритроцитами барана (Е-РОК) выявляет клетки крови, экспрессирующие на поверхности молекулы CD2 (зрелые Т-лимфоциты, ЕК). Постановка реакции (рис. 2): к отмытым эритроцитам барана добавляют суспензию мононуклеаров периферической крови человека (в соотношении ~10 : 1). Смесь центрифугируют и инкубируют при 37 ºС в течение часа. Затем вносят фиксатор (глутаровый альдегид 0,6 %, 10 мин), осторожно ресуспендируют, готовят мазки, окрашивают по Романовскому–Гимзе и подсчитывают процент РОК на 200 лимфоцитов в нескольких полях зрения. Розетка (розеткообразующая клетка) — лимфоцит, к которому присоединяются 3 и более эритроцитов. Присоединение меньшего количества эритроцитов считается результатом неспецифического связывания. Кроме определения собственно Т- и В-лимфоцитов (в последнем случае к лимфоидным клеткам добавляют эритроциты мыши), предпринимались попытки определять субпопуляции Т-клеток (теофилиновые розетки, терм ические розетки, Fcμ/Fcγ розетки и т. д.).

Рис. 2. Подсчет (выделение) Т-лимфоцитов методом Е-розеток (с эритроцитами барана)

2. Метод специфических или иммунных розеток основан на применении специального реагента — эритроцитарного диагностикума. Последний представляет собой фиксированные эритроциты быка, нагруженные моноклональными антителами против соответствующего CD (CD3, 4, 8 и др.). Постановка реакции не отличается от описанной в п. 1.

I I. Лимфоцитотоксический метод основан на образовании на поверхностной мембране лимфоцита комплекса «антиген–антитело», активирующего комплемент с последующим повреждением мембраны и лимфоцитолизом (рис. 3). «Положительные» клетки выявляют суправитальным окрашиванием красителями, которые активно секретируются во внешнюю среду живыми клетками (трипановый синий, нигрозин и др.).

Рис. 3. Подсчет Т-лимфоцитов с помощью лимфоцитотоксического метода

I II. Методы иммуноцитохимии (рис. 4) основаны на применении специфических моноклональных антител к антигенам CD (CD3, 4, 8 и др.). Метод пригоден для анализа суспензии мононуклеаров периферической крови и образцов тканей. Практически всегда применяют реакцию непрямого ИФА, иногда с усилением полезного сигнала с помощью антител против пероксидазы, меченных пероксидазой, или авидин-биотинового метода.

Рис. 4. Определение количества Т-лимфоцитов методом иммуноцитохимии

На первом этапе готовят мазки (срезы), высушивают, фиксируют согласно рекомендациям изготовителя антител. Далее проводят окрашивание антителами (наносят на мазок каплю антител в соответствующем разведении), инкубируют до 24 ч во влажной камере, промывают и добавляют конъюгат (антиглобулиновая сыворотка с ферментом). После инкубации (30–60 мин) отмывают и наносят раствор хромогена (обычно ДАБ либо АЕК). После инкубации (30–60 мин) отмывают, докрашивают, заключают в бальзам и микроскопируют. Положительные клетки выглядят коричнево-черными (ДАБ) или красными (АЕК). Подсчитывают процент положительных клеток на 200 лимфоцитов в нескольких полях зрения.

IV. Методы иммунофлуоресценции (РИФ) позволяют иммунофенотипировать лимфоциты с использованием меченных флуорохромами моноклональных антител к CD лимфоцитов (CD3, 4, 8 и др.). В зависимости от способа учета выделяют:

1. Методы с учетом на флуоресцентном микроскопе пригодны для анализа суспензии мононуклеаров периферической крови или образцов тканей. На первом этапе готовят препарат клеток или срез, высушивают, фиксируют согласно рекомендациям производителя антител. Далее окрашивают препарат моноклональными антителами. Реакция может осуществляться как в прямом, так и в непрямом вариантах. Учет проводят с помощью флуоресцентного микроскопа; подсчитывают процент положительных клеток с характерным свечением (мембранное или свечение всей клетки) и морфологией на 200 лимфоцитов. Метод не нашёл широкого применения ввиду трудоёмкости анализа при оценке большого количества маркёров.

2. Методы с учетом на проточном цитофлуориметре пригодны для анализа цельной крови, суспензии мононуклеаров крови или суспензии клеток, выделенных из образцов тканей. Как правило, реакция проводится в прямом варианте.

На первом этапе в пробирки вносят оптимальное количество антител и добавляют 50–100 тыс. клеток (100 мкл крови). Пробирки встряхивают и инкубируют 1 ч при 4 ºС. Далее отмывают клетки (лизируют эритроциты, если окрашивали цельную кровь) и фиксируют 1%-ным параформальдегидом. Учет обычно проводят в день постановки теста (при надлежащей фиксации клетки могут сохраняться длительно) и осуществляют с помощью проточного цитофлуориметра (рис. 5–8).

Прибор работает по следующему принципу: исследуемые клетки подаются по капилляру к измерительной камере. Диаметр капилляра и скорость потока обеспечивают прохождение клеток через камеру одна за другой. Через измерительную камеру проходит луч лазера. При перекрывании луча прибор регистрирует объект и учитывает параметры прямого рассеяния (размер объекта) и бокового рассеяния (структура объекта) (рис. 6). Если объект связал антитела, меченные флуорохромом, происходит вспышка зеленого (флуоресцеин), красного (фикоэритрин) или другого цвета. Компьютер располагает объекты в системе координат: прямое/бо-ковое рассеяние, свечение в определенном диапазоне и т. д. Как правило, объекты хорошо разделяются по морфологическим и цветовым свойствам, поэтому не составляет труда выделить ту или иную группу и рассчитать соответствующую статистику (процент светящихся клеток и интенсивность свечения). Кроме того, для дальнейшего анализа можно задавать прибору область параметров, которым соответствуют инт ересующие исследователя объекты.

Рис. 5. Определение количества клеток крови с применением проточной цитофлуориметрии

Важнейшим преимуществом цитофлуориметрии является высокая скорость анализа (1000 измерений в минуту) и возможность одновременной окраски клеток-объектов различными антителами, меченными флуорохромами соответствующих цветов (до 4–5). Это позволяет устранить ошибки анализа, связанные с перекрестной экспрессией маркеров на ИКК: CD2 — на Т-клетках и ЕК; молекулы HLA-DR — на активированных Т-клетках, В-клетках и АПК; молекулы активации CD25, CD69 и рецептора апоптоза CD95 — на многих типах клеток. Кроме того, можно изучить более мелкие группы ИКК в пределах отдельных популяций: В1-лимфоциты (CD19+ CD5+) или Т-лимфоциты-регуляторы (CD3+ CD4+ CD25+ ИЛ10+) и другие клетки.

Рис. 6. Распределение лейкоцитов крови по прямому и боковому рассеянию света. Каждая точка соответствует измеренному объекту (клетке). Обычное количество объ-

ектов/анализ — 3000–5000. Время анализа — 20–60 с

Рис. 7. Диаграмма флуоресценции моно- Рис. 8. Распределение клеток, окрашен-

нуклеаров периферической крови, окра- ных антителами против CD3, мечены-

шенных антителами против CD4-антиге- ми ФИТЦ (зеленое свечение) и против

на, меченными ФИТЦ CD19, меченными ФЭ (красное свече-

ние)

Сравнительная характеристика методов определения количества Т-лимфоцитов. Методы розетирования с эритроцитами барана, мыши, ЕАС-розеток, а также лимфоцитотоксический тест в настоящее время имеют историческое значение, и применение их на практике может быть объяснено только данью традиции и недостаточным финансированием, но не современными требованиями клиники в области диагностики и мониторинга патологических состояний.

Эти методы предназначены для оценки только нормальных лимфоцитов периферической крови ex tempore, не могут быть стандартизированы, а учет результатов субъективен и в значительной мере зависит от опыта исследователя. Перечисленные особенности ограничивают диагностические возможности использующих их лабораторий и затрудняют сравнение и интерпретацию результатов в межлабораторной практике¹ (табл. 1).

Таблица 1

Сравнение методов определения количества лимфоцитов

Характеристика	Методы
	РО	ЛЦТТ	ИЦХ	ПЦ
Чувствительность	+	+	++	+++
Воспроизводимость	+/–	+/–	++	+++
Низкая себестоимость	++	++	+	–
Универсальность	–	–	++	+++
Возможность автоматизации	–	–	+	+
Высокие требования к оборудованию	–	–	–	++
Биологическая безопасность	–	+	+	+
Метод выбора при постоянном проведении умеренного количества исследований	–	–	+	–
Метод выбора при постоянном проведении большого количества исследований	–	–	–	+

Современные методы, основанные на связывании моноклональных антител с хорошо охарактеризованными лигандами (CD и др.) с образованием стабильных комплексов на поверхности или внутри клетки, широко применяются и являются методом выбора в настоящее время.

Популярность ИЦХ обусловлена сравнительной простотой, стандартностью (при условии использования качественных антител отечественного производства), возможностями проведения массовых исследований, внедрения в существующие лаборатории с минимальными затратами (при световой микроскопии), а также хранения и транспортировки препаратов. Сравнение двух основных вариантов постановки метода приведено в табл. 2.

Таблица 2

Особенности иммунофлуоресцентной и иммуноферментной цитохимии при визуализации антигенов клеток крови

Особенности	Иммунофлуоресцентный метод	Иммуноферментный метод
Оборудование	Люминесцентный микроскоп	Световой микроскоп
Соотнесение с морфологией	–	+
Оптимальные сроки учета результатов	Сутки	Недели
Транспортировка готовых препаратов	–	+
Архивное хранение препаратов	–	+
Концентрация первых и вторых антител	Высокая	Низкая
Возможность автоматизации	–	+

Отрицательными моментами являются субъективность визуальной оценки, трудности организации контроля качества и работы с малоклеточными популяциями (активированными клетками, бластами при минимальной остаточной болезни, гемопоэтическими стволовыми клетками).

В настоящее время не только в клинически сложных случаях (онкогематологические заболевания, трансплантация костного мозга и стволовых клеток), но и в повседневной практике клинической иммунологии все чаще применяется ПЦ. Это связано с важными преимуществами ПЦ при определении маркеров на поверхности и внутри клеток перед другими методами, а также следующим:

1. уменьшением стоимости проточных цитометров;

2. доступностью реагентов отечественного производства;

3. конкуренцией на рынке иммунологических исследований и ростом осведомленности врачей и пациентов о преимуществах ПЦ.