Введение

Лимфоциты — популяция иммунокомпетентных клеток, отвечающих за специфичность ответа иммунной системой на повреждение. Абсолютное содержание в крови 1,5–2,5 ∙ 10⁹/л; относительное — 18–38 % белых клеток крови. Лимфоциты у взрослых возобновляются за счет интенсивного размножения в периферических органах иммунной системы. Считается, что 1–3 % лимфоцитов обновляется каждый день.

Основные свойства лимфоцитов — способность к быстрому размножению клеток (клон), специфичных (реагирующих с ним с достаточной аффинностью) к какому-либо антигену, и организация мощного иммунного ответа на него. Таким образом, лимфоциты не только сами уничтожают антиген, но и мобилизуют, фокусируют ответ других звеньев иммунной системы (прежде всего, механизмов врожденного иммунитета).

Лимфоциты имеют сходную морфологию и жизненный цикл: малый лимфоцит – лимфобласт – большой лимфоцит – средний лимфоцит – малый лимфоцит (в случае В-лимфоцитов: лимфобласт – юная и зрелая плазматическая клетки). В крови обычно находится около 1 % всех лимфоцитов организма; по морфологии — это малые (покоящиеся) лимфоциты: округлые клетки ~8 мкм с круглым ядром и узким ободком (серпом) цитоплазмы. В крови присутствуют и другие формы лимфоцитов (средние и большие). На сегодняшний день классические методы цитоморфологии не позволяют точно определить тип лимфоцита и/или его функциональное состояние (за исключением плазматических клеток).

Современные методы оценки количества и функции лимфоцитов основаны на следующем:

1. исследовании в образцах крови и тканей (срезы, тканевые культуры, выделенные лимфоциты):

а) молекул клеточной поверхности лимфоцита: CD, TKP, BKP и поверхностных иммуноглобулинов;

б) содержания внутриклеточных молекул: цитокинов, иммуноглобулинов, факторов апоптоза, компонентов сигнальных путей, транскрипционных факторов;

в) секреции цитокинов;

г) внутриклеточного содержания мРНК: цитокинов, эффекторных молекул, продуктов генов ТКР и ВКР, любых белков;

2. воспроизведении основных феноменов иммунитета in vitro или in vivo с регистрацией прямого или косвенного эффекта.

К сожалению, многообразие методов и параметров лимфоцитов, которые можно оценивать на современном этапе, зачастую не дают значимого эффекта для лечения как соматических/инфекционных заболеваний, так и заболеваний самой иммунной системы.

Методы выделения лимфоцитов

Как правило, для исследования функции клеток их необходимо выделить из сложной смеси различного состава. Для различных типов материала разработаны соответствующие методы выделения лимфоцитов:

1. Выделение лимфоцитов из крови осуществляют методом градиентного центрифугирования (рис. 1): из инертных полисахаридов готовят раствор с плотностью равной плотности лимфоцитов (1,077), осторожно наслаивают сверху стабилизированную антикоагулянтом кровь и центрифугируют. Эритроциты и гранулоциты проваливаются под градиент, мононуклеары (лимфоциты и моноциты) остаются над градиентом в виде мутно-белого кольца или диска. Этот слой забирают пипеткой и отмывают от полисахарида.

2. В ыделение лимфоцитов из ткани: ткань гомогенизируют, обрабатывают ферментами (протеаза, коллагеназа, ДНК-аза), пропускают через специальные сита. Крупные конгломераты удаляют отстаиванием. Полученную клеточную взвесь наслаивают на ступенчатый или непрерывный градиент плотности и центрифугируют. Нужную фракцию клеток забирают с поверхности градиента с плотностью 1,077.

Рис. 1. Метод градиентного центрифугирования для получения лимфоцитов (мононуклеаров) крови