2. Количественное определение общего белка сыворотки крови по биуретовой реакции

Белки сыворотки крови при взаимодействии с сульфатом меди в щелочной среде образуют за счет своих пептидных связей комплексные соединения с ионами меди фиолетового цвета. Интенсивность окрашивания раствора находится в прямой зависимости от концентрации в нем белка.

К 0,1 мл сыворотки крови прибавляют 5,0 мл рабочего раствора биуретового реактива. Одновременно ставят контроль. К 0,1 мл 0,9% раствора хлорида натрия прибавляют 5 мл рабочего биуретового реактива. Через 30 минут измеряют оптическую плотность раствора на фотоэлектроколориметре при длине волны 540-560 нм (зеленый светофильтр) против контроля.

Для построения калибровочного графика из стандартного 5% раствора белка готовят рабочие стандартные растворы, как указано в таблице 8. Из каждого разведения берут по 0,1 мл рабочего раствора и прибавляют по 5 мл рабочего биуретового реактива; через 30-60 минут измеряют оптическую плотность на фотоэлектроколориметре против контроля. По полученным данным строят калибровочный график. Норма - 6,5-8,5% белка. При содержании белка в сыворотке больше 10% сыворотку разводят физиологическим раствором, а результаты умножают на коэффициент разведения.

Таблица 8. Состав смесей для построения калибровочного графика.

№ п/п	Стандартный раствор белка, мл	0,9% раствор хлорида натрия, мл	Содержание белка в пробе, г	Концентрация белка, %
1	0,4	0,6	0,02	2
2	0,6	0,4	0,03	3
3	0,8	0,2	0,04	4
4	1,0		0,05	5

3. Определение кальция в сыворотке крови по методу де Ваарда.

В центрифужную пробирку отмеряют 2 мл дистилированной воды. Приливают 1 мл сыворотки крови. Затем добавляют 1 мл насыщенного раствора оксалата аммония и оставляют на 10 мин, после чего центрифугируют 5 минут. Оксалат кальция образует плотный белый осадок на дне пробирки. Жидкость над осадком сливают. Осадок промывают, добавляя в пробирку 4 мл 2% раствора гидроксида аммония. Вновь центрифугируют 5 минут. Сливают аммиак с осадка и наливают в пробирку 2 мл 1 н. серной кислоты, осадок размешивают стеклянной палочкой. Берут еще одну пробирку и наливают 2 мл 1 н. серной кислоты (контроль). Погружают пробирки на 1-2 минуты в кипящую водяную баню. Горячий раствор титруют из микробюретки 0,01 н раствором перманганата калия до появления бледно-розового окрашивания, исчезающего в течение минуты. Из израсходованного количества перманганата калия в опытной пробе вычитают количество перманганата, пошедшее на титрование контрольного опыта.

Пример расчета: 1 мл 0,01 н раствора перманганата калия эквивалентен 0,0499 ммоль кальция. На титрование сыворотки было затрачено 0,54 мл перманганата калия, на титрование контрольного опыта 0,05 мл перманганата калия, отсюда содержание кальция в сыворотке равно:

(0,54-0,05)*0,04990*100=2,044 ммоль/л.