Контрольные вопросы
1. Какие факторы определяют биологическую ценность пищевых белков?
2. Какие условия необходимы для переваривания белков в желудке?
3. Присутствие каких веществ в желудочном соке определяет его общую кислотность?
4. Как предотвращается действие пептидаз на клетки желудка и кишечника?
Работа 4. Конечные продукты азотистого обмена
Опыт 1. Биуретовая реакция на мочевину.
Главным конечным продуктом белкового обмена является мочевина. Синтез мочевины происходит в печени из аммиака и диоксида углерода в результате цепи последовательных реакций при участии АТФ. В норме за сутки с мочой человека при обычной смешанной пище выводится около 30 г мочевины (0,5 моль/сут). Увеличение количества мочевины в моче наблюдается при богатой белками пище и при заболеваниях, связанных с усиленным распадом собственных белков организма (лихорадка, гипертиреоз, диабет). Уменьшение выделения мочевины отмечается при пище, бедной белками, при заболевании почек, когда затруднено выделение мочевины, при заболеваниях печени, характеризующихся нарушением синтеза мочевины, при ацидозах в силу недостаточного синтеза мочевины вследствие образования большого количества аммонийных солей.
Несколько кристаллов мочевины помещают в сухую пробирку и расплавляют на пламени до начала затвердевания расплавленной массы. От мочевины отщепляется аммиак и образуется биурет. Аммиак обнаруживают по запаху и по посинению в парах красной лакмусовой бумажки, смоченной водой. Полученный в пробирке биурет охлаждают, затем растворяют в 0,5 мл 10% раствора гидроксида натрия и добавляют 1-2 капли 1% раствора сульфата меди. Розовое окрашивание обусловлено образованием комплексной медной соли биурета.
Опыт 2. Разложение мочевины под действием гипобромита натрия.
К 2-3 мл 5%-ного раствора мочевины приливают 1 мл свежеприготовленного раствора гипобромита натрия. Наблюдают выделение газа. Мочевина разлагается согласно уравнению:
Эту реакцию применяют для количественного определения мочевины в моче.
Опыт 3. Качественное обнаружение аминокислот в моче.
У взрослых здоровых людей за сутки выводится 100-400 мг аминокислот, что составляет 2% общего азота мочи. Аминоацидурия отмечается при заболеваниях печени с поражением паренхимы (гепатиты, цирроз, болезнь Боткина). Содержание аминокислот в моче повышается при заболеваниях, сопровождающихся распадом тканей. Усиленное выделение отдельных аминокислот наблюдается при врожденных и наследственных болезнях обмена веществ (фенилпировиноградная олигофрения, алкаптонурия и др.).
К 0,5 мл мочи добавляют 0,5 мл 0,2% раствора нингидрина в спирте, насыщенном ЭДТА (динатриевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты). Содержимое пробирки нагревают и наблюдают появление синего окрашивания, обусловленного образованием продукта взаимодействия аминокислот с нингидрином.
Опыт 4. Количественное определение аммиака в моче по Мальфатти.
Аммонийные соли образуются при нейтрализации аммиаком кислот, поступающих в организм извне или получающихся в организме в процессах обмена веществ. В виде аммонийных солей в норме с мочой за сутки выделяется 0,5-1,2 г аммиака. Выведение аммиака с мочой значительно увеличивается при заболеваниях, сопровождающихся ацидозом, например, при сахарном диабете, когда образуются кетоновые тела (ацетоуксусная кислота, -гидроксимасляная кислота) и увеличивается количество фосфорной и серной кислот в связи с усилением расщепления тканевых белков. Уменьшение количества аммиака в моче характерно для поражения почек за счет потери способности получать аммиак из глутамина.
Отмеряют в колбу 5 мл мочи, добавляют 25 мл дистиллированной воды, 2 капли раствора фенолфталеина и титруют 0,1 н. раствором гидрокисда натрия до появления слабо-розовой окраски. Этим достигается нейтрализация веществ кислотного характера, содержащихся в моче. Добавляют 2 мл формалина. Смесь обесцвечивается вследствие разложения аммиачных солей и появления в растворе кислоты.
Смесь вновь титруют 0,1 н. раствором NaOH до розового окрашивания. Количество израсходованных при последнем титровании миллилитров щелочи умножают на 0,0017 (титр 0,1 н. раствора аммиака) и получают массу аммиака во взятом для анализа объеме мочи. Рассчитайте, сколько аммиака выделилось с мочой за сутки, если ее суточный объем 1200 мл. Сделайте вывод о наличии или отсутствии ацидоза.
Опыт 5. Реакция на креатинин с нитропруссидом натрия (реакция Вейля).
Креатинин - один из конечных продуктов азотистого обмена. Он образуется в мышцах из креатинфосфата, который, в свою очередь, получается из креатина и АТФ. За сутки с мочой выделяется 0,5-2 г креатинина. Увеличение выделения креатинина наблюдается при повышенной мышечной деятельности, лихорадке, сахарном диабете и других заболеваниях, связанных с интенсивным распадом белков тканей организма. Выделение креатинина уменьшается при мышечной атрофии, прогрессирующем поражении почек и др.
а) К 0,5 мл мочи добавляют 1-2 капли 5% раствора нитропруссида натрия и добавляют 1-2 капли 10% раствора гидроксида натрия. Креатинин с нитропруссидом натрия Na2[Fe(CN)5NO] в присутствии щелочи дает изонитрозокреатинин красного цвета, но соединение нестойкое — красная окраска быстро переходит в желтую.
б) При добавлении к содержимому пробирки нескольких капель концентрированной уксусной кислоты (до кислой реакции) красная окраска сменяется желтой.
Опыт 6. Количественное определение креатинина в моче по цветной реакции Яффе (метод Поппера).
Креатинин, взаимодействуя с хиноидной формой пикриновой кислоты, образует пикрат креатинина, который в щелочной среде превращается в свою таутомерную форму, имеющую оранжево-красный цвет. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации креатинина.
В мерную колбу на 100 мл отмеряют из суточного количества 0,5 мл мочи и 3 мл насыщенного раствора пикриновой кислоты. Встряхивают и добавляют 0,2 мл 10% раствора гидроксида натрия. На 10 минут оставляют при комнатной температуре, после чего дистиллированной водой доводят объем до 100 мл. Оптическую плотность измеряют на фотоэлектроколориметре в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 510-560 нм (зеленый светофильтр) против контроля.
Одновременно ставят контрольную пробу. В мерной колбе на 100 мл смешивают 3 мл насыщенного раствора пикриновой кислоты и 0,2 мл 10% раствора гидроксида натрия, доводят водой до метки.
Стандартная проба. В мерную колбу на 100 мл наливают 0,5 мл основного стандартного раствора креатинина и 3 мл насыщенного раствора пикриновой кислоты. Встряхивают и прибавляют 0,2 мл 10% раствора гидроксида натрия. Далее пробы обрабатывают так же, как и опыт.
Расчет производят по формуле:
,
где х - количество креатинина в суточной моче, мг; Сст - количество креатинина в стандартной пробе, мг; Dоп — оптическая плотность опытной пробы; Dст - оптическая плотность стандартной пробы; Vсут - суточное количество мочи; V - количество мочи, взятой для анализа.
Полученные данные сопоставить с нормальными величинами содержания креатинина в суточной моче. В норме содержание креатинина в моче у мужчин равно 1-2 г/сут (8,8-17,7 ммоль/сут), у женщин - 0,8-1,8 г/сут (7,1-15,9 ммоль/сут).