1. Трансдукция.

Вектор - молекула ДНК или РНК, состоящая из двух компонентов: векторной части (носителя) и клонируемого чужеродного гена. Задача вектора – донести выбранную ДНК в клетку-рецепиент и встроить ее в геном.

В состав вектора должен входить маркерный ген, позволяющий селектировать измененные клетки. Можно выделить 2 группы маркерных генов:

- селективные гены, отвечающие за устойчивость к антибиотикам или гербицидам;

- репортерные гены, кодирующие нейтральные для клеток белки, наличие которых в тканях может быть легко тестировано.

За способность гена к экспрессии отвечают регуляторные последовательности, которые также необходимо встроить в векторную молекулу.

Типы векторов:

- бактериальные плазмиды. Одна их наиболее часто употребляемых плазмид для клонирования pBR 322 создана на основе плазмид, выделенных из E. coli;

- вирусы. Есть вирусы, которые не ведут к гибели клетки, но встраиваются в геном клетки-хозяина и размножаются вместе с ней, либо вызывают ее неконтролируемый рост, т.е. превращают в раковую;

- гибридные векторы, содержащие ДНК фага и плазмиды - космиды и фазмиды.

2. Прямое введение гена в клетку – трансформация. Ее виды:

Трансфекция. ДНК адсорбируется на кристаллах фосфата кальция. Они поглощаются клеткой путем фагоцитоза.

Микроинъекция ДНК с помощью микропипеток диаметром 0.1-0.5 микрона и микроманипулятора.

Электропорация основана на том, что импульсы высокого напряжения обратимо увеличивают проницаемость биомембран.

«Мини-клетки» получают путем блокирования донорных клеток в митозе колцемидом. Вокруг каждой хромосомы формируется новая ядерная мембрана. Затем их обрабатывают цитохалазином В и центрифугируют. Образуются мини-клетки - микроядра, инкапсулированные в цитоплазматическую мембрану. Для их слияния подбирают специальные мягкие условия.

Упаковка в липосомы используется для защиты экзогенного генетического материала от разрушающего действия рестриктаз.

Метод биологической баллистики является одним из самых эффективных на сегодняшний день методов трансформации растений. На мельчайшие частички вольфрама напыляется ДНК вектора. Они помещаются внутрь биолистической пушки, откуда с огромной скоростью выбрасываются и, разрывая клеточные стенки, входят в цитоплазму и ядро клеток.

С развитием генной инженерии появилась возможность заставить микроорганизмы синтезировать вещества, которые получить другими методами сложно - интерферон, инсулин, соматостатин, соматотропин, фермент урокиназу, некоторые факторы свертывания крови и др. Все эти белки применяются для лечения болезней.

Плазмиды можно ввести и в клетки эукариот. Генетическая транформация соматических клеток млекопитающих позволяет изучать тонкие механизмы регуляции экспрессии генов и целенаправленно модифицировать генетический аппарат клетки, что имеет огромное значение для медицинской генетики. Культуры трансформированных клеток млекопитающих используют для получения различных веществ.

Генотерапия - лечение заболеваний с помощью генов. Существует два типа генотерапии.

Заместительная генотерапия заключается во вводе в клетку неповрежденного гена.

При корректирующей генотерапии осуществляется замена дефектного гена нормальным в результате рекомбинации. Пока этот метод на стадии лабораторных испытаний, и эффективность его еще очень низка.

Генная терапия может проводиться либо в культуре клеток (ex vivo), либо непосредственно в организме (in vivo).

Генотерапию используют для коррекции нарушения при прогрессирующей мышечной дистрофии Дюшенна, муковисцидозе - тяжелом наследственном заболевании легких. Наследственные заболевания, которые пытаются или планируют лечить генами, - ревматоидный артрит, фенилкетонурия, заболевания, связанные с недостатком гормонов (инсулина, эритропоэтина, гормона роста).

Генотерапия применима не только к наследственным заболеваниям. Предстоит решить проблему лечения генами синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД). ВИЧ представляет собой ретровирус, поражающий Т-лимфоциты и макрофаги. Болезнь удалось бы победить, если бы были найдены новые гены, введение которых в зараженные ВИЧ лимфоциты останавливало бы дальнейшее размножение вируса.

Получение трансгенных животных. Для изменения свойств всего организма следует изменять геном половых клеток, которые перенесут новые свойства потомкам. Разработаны способы введения генов в эмбриональные клетки млекопитающих, мух и некоторых растений. Микроинъекцию клонированных генов производят в оплодотворенную яйцеклетку, затем ее имплантируют в яйцевод приемной матери. Можно вводить ген в сперматозоиды и затем проводить ими оплодотворение.

В Англии созданы трансгенные овцы, молоко которых содержит фактор свертывания крови. Создан трансгенный крупный рогатый скот, содержащий в молоке человеческий альбумин. Каждая молочная корова может произвести 80 кг рекомбинантного человеческого альбумина ежегодно. Трансгенных животных получают и для трансплантации органов. Одним из излюбленных доноров органов являются свиньи, так как имеется анатомическое сходство органов и сходство иммунологических свойств. Реакции отторжения при трансплантации имеют сложный механизм. Одним из сигналов для атаки организма на чужой орган являются белки, локализованные на внешней поверхности мембраны. У трансгенных свиней эти белки заменены на человеческие.