3.3. Генная инженерия

Генная инженерия - система экспериментальных приемов, позволяющих конструировать лабораторным путем (в пробирке) искусственные генетические структуры в виде так называемых рекомбинантных или гибридных молекул ДНК.

Технология рекомбинантных ДНК использует следующие методы:

1. Специфическое расщепление ДНК рестриктазами. В качестве мишеней рестриктаз часто выступают палиндромы из 4-6 пар оснований - сайты рестрикции. Одни рестриктазы вносят разрывы по оси симметрии, образуются так называемые "тупые" концы. Другие - со сдвигом, образуются "липкие" концы, то есть фрагменты имеют на своих концах однонитевые взаимно комплементарные участки длиной в четыре нуклеотида. Такие фрагменты особенно удобны для создания рекомбинантных ДНК.

2. Секвенирование нуклеотидов. С помощью электрофореза фрагменты ДНК, различающиеся по размеру, можно разделить, а затем исследовать каждый фрагмент отдельно. Это позволяет построить рестрикционную карту, на которой указано положение каждого сайта рестрикции относительно других участков.

3. Конструирование рекомбинантной днк:

Для получения рекомбинантной ДНК плазмиды выделяют из Е. coli и удаляют из них часть кольцевой молекулы ДНК с помощью рестриктазы. Комплементарные цепи молекулы ДНК разрезаются в разных местах, в результате чего образуются «липкие» концы. На фрагменте ДНК, выбранном для пересадки, создают «липкие» концы, используя ту же рестриктазу. Если смешать фрагмент ДНК (ген) и плазмиду, то они соединятся «липкими» концами. Затем с помощью лигазы вновь получают кольцевую молекулу ДНК, но теперь она вместе с плазмидной ДНК содержит ген, выбранный для пересадки. Это и есть рекомбинантная ДНК.

Возможны:

- сшивка по одноименным "липким" концам (рестриктазно лигазный метод). Комплементарные друг другу участки имеют тенденцию к ассоциации за счет спаривания оснований. Для восстановления разрывов используют фермент ДНК-лигазу.

- сшивка по "тупым" концам (коннекторный метод). Тупые концы могут быть соединены ДНК-лигазой. Эффективность реакции ниже, чем при сшивке по липким концам.

- сшивка фрагментов с разноименными липкими концами. Применяют линкеры - химически синтезированные олигонуклеотиды, представляющие собой сайты рестрикции или их комбинацию. Существуют линкеры "тупой конец - липкий конец".

Описанная выше процедура сложна и позволяет получать лишь очень небольшие количества рекомбинантной ДНК.

4. Клонирование (размножение) рекомбинантной днк:

- клонирование ДНК in vivo.

Если к культуре Е. coli добавить рекомбинантные плазмиды, то они могут включаться в бактериальные клетки — получаются рекомбинантные бактерии. Плазмиды в клетке начинают реплицироваться. При размножении бактерий вновь образующиеся бактериальные клетки тоже содержат эти плазмиды. Из рекомбинантных бактерий можно выделить клонированные рекомбинантные плазмиды, а из них — исследуемый фрагмент ДНК. Таким путем можно выделить ген или любой другой фрагмент ДНК в количествах, достаточных для исследовательских целей.

- аплификация (увеличение числа копий) ДНК in vitro.

В 1985 году К. Мюллис с сотрудниками разработали метод клонирования последовательностей ДНК in vitro, который получил название полимеразной цепной реакции (ПЦР). К анализируемому образцу ДНК добавляют в избытке 2 синтетических праймера. Праймеры ориентированы таким образом, что синтез с помощью полимеразы протекает только между ними, удваивая количество копий этого участка ДНК. Амплифицированный участок называют ампликоном. Амплификация заключается в повторяющихся циклах, представляющих собой трехступенчатый процесс: I - денатурация ДНК при 95°С; II - отжиг праймеров с комплементарными последовательностями (40-60°С); III - последующая достройка полинуклеотидных цепей от праймеров с помощью ДНК-полимеразы при температуре 70-75°С (рис. 8).

Продолжительность одного цикла менее 3 мин. Таким образом, за 2 ч можно получить около миллиарда копий определяемой последовательности ДНК. Размноженный in vitro фрагмент получают в количествах, достаточных для его прямого секвенирования. ПЦР иногда называют бесклеточным молекулярным клонированием (cell-free molecular cloning).

Рис. 8. Амплификация ДНК in vitro.

С использованием ПЦР разработаны новые диагностические тесты на генетические и инфекционные заболевания. Метод используют для ранней диагностики наличия в организме вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). Метод анализа индивидуальных сперматозоидов нашел практическое применение в судебной медицине. С помощью ПЦР удалось амплифицировать и клонировать фрагменты митохондриальной ДНК из ископаемых останков мозга человека возраста 7 тысяч лет.

5. Введение гена в клетку. Ген нужно ввести в клетку таким образом, чтобы он не был разрушен клеточными нуклеазами, а интегрировался с геномом клетки. Используют 2 способа.