Способ Нейссера

1. Фиксированный мазок окрашивают уксуснокислым метиловым си- мим 1 минуту, сливают краситель, промывают водой.

2. Наливают раствор Люголя на 20—30 секунд.

3. Не промывая водой, препарат окрашивают везувином 10—15 ми- нут, после чего промывают водой и высушивают.

29

фиксируют (наносят 2—3 капли спирта й Сжйгайт его йа I п'кле), на остывшее стекло наливают фуксин Пфейффера На Л—5 минут, промывают.водой, высушивают.

Бактерии окрашиваются в красный цвет, неокрашенные капсулы контрастно выделяются на темном фоне препарата Иногда вокруг окрашенных бактерий, не образующих кап-

Рис. 16. Расположение жгутиков у бактерий. / — 2 —. Монотрихи; 3 — лофотрихи; 4 — перитрихи.

сул, обнаруживаются небольшие бесцветные зоны — лож­ные капсулы, которые появляются в результате неправиль­ною высушивания или фиксации мазка.

Жгутики — органоиды движения некоторых видов бакте­рий. Они состоят из фибриллярного белка — флагеллина, отличающегося от белков тела клетки. Жгутики очень тон­ки, диаметр их 0,02—0,05 р,, длина 6—9 р, и больше, т. е. во много раз длиннее бактерий.

Строение жгутиков винтообразное. Передвижение бакте­рий связано со спиралевидными движениями жгутиков. По Расположению их подвижные микробы условно разделяют на 3 группы:

31

1. монотрйхи (рис. 16, lj 2) — бактерий с одним жгути­ком на конце (Vibrio cholerae — холерный вибрион, Pseudo-monas aeruginosa — бактерия синезеленого гноя);

2. лофотрихи (рис. 16, 3) —бактерии с пучком жгутиков на одном конце (Pseudomonas syncyanea — бактерия синего молока, Alcaligenes faecalis — фекальный щелочеобразова-тель);

3. перитрихи (рис. 16, 4) —бактерии со жгутиками, рас­положенными по всей поверхности тела (Escherichia coli — кишечная палочка, Salmonella typhosa—сальмонелла брюш­ного тифа, Salmonella paratyphi, Salmonella schottmuelle-ri — сальмонеллы паратифов А и В).

Возможно есть и амфитрихи — бактерии, имеющие по пуч­ку или одному жгутику на обоих концах (Pseudomonas fluorescens — бактерия флюоресцирующая, Spirillum volu-tans — спирилла, содержащая зерн# волютина), самостоя­тельное существование которых оспаривается. Некоторые исследователи полагают, что амфитрихи представляют собой две клетки, деление которых еще не завершено.

Жгутики у бактерий обнаруживают различными способа­ми. Строение их и другие детали изучают методом электрон­ной микроскопии.

Расположение и количество жгутиков определяют в спе­циально окрашенных препаратах.

Окраска жгутиковпо методу Грея. Для приготовления препарата и окраски бактерий со жгутиками следует строго соблюдать следующие требования:

1. Взвесь бактерий готовят заранее. Петлей берут налет вблизи кон­денсационной воды из 15—18-часовой культуры на плотной среде и осто­рожно погружают ее в 2 мл стерильной водопроводной воды. После распределения культуры в воде без взбалтывания ее осторожно извле­кают петлю, а взвесь помещают в термостат на 30 минут.

2. Несколько капель взвеси наносят пастеровской пипеткой на совер­шенно обезжиренное, хорошо прокаленное на пламени и остужен­ное предметное или проведенное через пламя покровное стекло и дают им высохнуть на воздухе. Стекло быстро проводят через пламя горелки.

3. Препарат обрабатывают протравой, подогревая до появления па­ров. После охлаждения промывают водой. Програва состоит из 5 мл насыщенного водного раствора A1K(S0₄)₂' 12Н₂0, 2 мл 20% водного раствора танина и 2 мл насыщенного водного раствора HgCl₂. Протра­ву готовят заранее (для хранения добавляют несколько капель хлоро­форма). Перед употреблением фильтруют.

4. Препарат окрашивают без нагревания свежеотфильтрованным фуксином Циля в течение 5 минут, осторожно, но тщательно промывают водопроводной водой,

5. высушивают на воздухе и микроскопируют им­мерсионной системой. Принцип окраски заключается в искусственном увеличении жгутиков за счет наслоения протравы.

32

Рис. 13. Окраска возбудителя дифтерии, орикебактерии дифтерии, окрашенные уксуснокислым метиловым фиоле-Г01ЫМ; б — коринебактерии дифтерии, окрашенные по Нейссеру.

Исследование микробов в живом состоянии методом «раз­давленной» и «висячей» капли. В живом состоянии у бак­терий изучают процессы размножения, спорообразования, лияния различных химических и физических факторов. • практических лабораториях изучение микробов в живом состоянии используют для определения подвижности, т. е. косвенного подтверждения наличия у них жгутиков.

Рис. 22. Borrelia recurrent is в крови больного возвратным тифом.

в

Рис. 34. Токсоплазмы, окрашенные по Романовскому— Гимзе.

в

Движение микробов наблюдаются в препаратах «раздав-дленной» и «висячей» капли. Микроскопируют эти препараты сухим или иммерсионным объективом, более четкие резуль­таты получают при микроскопии в темном поле или в фазо­вом контрасте.

«Раздавленная» капля. На середину предметного стекла наносят каплю исследуемого материала. Каплю на-* крывают покровным стеклом так, чтобы не появились пу­зырьки воздуха; жидкость должна заполнить все простран­ство и не выступать за края стекла.

Недостатком «раздавленной» капли является быстрое ее высыхание. При длительном микроскопировании рекомен­дуют смазывать края покровного стекла вазелином или го­товить «висячую» каплю.

33

Объясняется это наличием плотной оболочки, небольшой концентрацией свободной доды и высоким содержанием ли-*пидов. В препаратах, окрашенных простыми способами или По Граму, споры остаются бесцветными. Окраску спор производят специальными методами по Ожешке или Пе­шкову.

Метод Ожешки. Мазок высушивают на воздухе, на-лпвают 0,5% раствор соляной кислоты (протрава) и подо-I певают до появления паров. Затем препарат промывают во-

«Висячая» капля. Для приготовления этого пре­парата используют специальные предметные стекла с углуб­лением (лункой) в центре. Небольшую каплю исследуемого материала наносят на середину покровного стекла. Края лунки предварительно смазывают вазелином. Предметное стекло накладывают на покровное так, чтобы капля находи­лась в центре лунки. Затем стекло осторожно переворачи­вают, и капля свисает в центре герметически закрытой по­лости лунки (рис. 17), в такой замкнутой полости капля за­щищена от высыхания.

О писанные препараты микроскопируют, слегка затемняя поле зрения; конденсор при этом опускают, поступление света регулируют вогнутым зеркалом., Вначале пользуются, малым увеличением (объектив 8), после того, как обнару­жат край капли, устанавливают объектив 40 или иммерсион­ный.

При недостаточном опыте пассивное молекулярное (броу­новское) движение ошибочно принимают за истинное. Сле­дует учитывать, что, передвигаясь с помощью жгутиков, бак­терии могут пересекать все поле зрения и совершать кру­говые и вращательные движения.

Примечание. Препараты «раздавленной» и «висячей» капли пос­ле работы следует опускать в отдельную ванночку с дезинфицирующим раствором, чтобы сохранить покровные стекла для дальнейшего исполь­зования.

Споры образуются чаще в неблагоприятных условиях (в почве, при старении культур в питательных средах), рас­положены они внутриклеточно, имеют круглую или оваль­ную форму. Микробы, диаметр спор которых превышает по­перечник клетки, относят к роду клостридий. Функцией спор является сохранение вида. Бациллы и клостридий обычно образуют по одной споре. В организме человека и животных спорообразование не наблюдается.

Расположение спор (рис. 18) в клетке может быть: цент­ральное (/ — бациллы сибирской язвы); субтерминальное (2— клостридий ботулизма, газовой анаэробной инфекции); терминальное (3— клостридий столбняка).

При определении вида бацилл и клостридий учитывается не только характер расположения спор в клетке, но также форма и диаметр их.

Споры по сравнению с вегетативными клетками обладают высокой устойчивостью к действию внешней среды. Они кислотоустойчивы и с трудом воспринимают красители.

34

Задания

1. Изучение нуклеоида в готовых препаратах.

2. Приготовление препарата из культуры пневмобактерий для обнаружения капсул. Окраска по Гинсу.

3. Окраска готовых мазков из дифтерийных коринебакте-рий по Нейссеру и уксуснокислым метиловым фиолетовым.

4. Приготовление и окраска препаратов из культуры ба­цилл с центральными спорами по Пешкову. Демонстрация окрашенных препаратов из культуры клостридий с терми­нальными и субтерминальными спорами.

5. Микроскопия бактерий со жгутиками, окрашенных по методу Грея (демонстрация).

6. Изучение подвижности бактерий: приготовление «раз­давленной» и «висячей» капли. Демонстрация подвижных микробов в «темном поле» и с помощью фазового контра­ста.