Задания

1. Постановка реакции торможения гемагглютинации и микропреципитации.

2. Приготовление мазков из оспенной вакцины, окраска по методу Морозова, микроскопия.

3. Демонстрация измененной хорионаллантоисной обо­лочки куриного эмбриона, зараженного вирусом вакциЩы.

4. Освоение методики противооспенных прививок.

Реакция связывания комплемента имеет целью обнару­жить антиген в патологическом материале или антитела в крови больного. В качестве антигена используют содер­жимое везикул или пустул, а также вытяжки из корок, в ка­честве антитела — известную кроличью иммунную сыворот­ку. Антитела в сыворотке больных обнаруживают с 8—9-го дня от начала болезни. Учитывая наличие антител у вакци­нированных, исследование повторяют для выявления нарас­тания титра.

Реакцию торможения гемагглютинации ставят с эритро­цитами кур. В качестве антигена служит культура вируса вакцины в дозе 4 гемагглютинирующих единиц. В сыворотке

274

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ПОЛИОМИЕЛИТА, КОКСАКИ И ECHO

Лабораторная диагностика полиомиелита

Возбудитель полиомиелита (Poliovirus) в антигенном от­ношении неоднороден, имеются типы I, II и III, которые определяются в культуре ткани серологическими реакциями и в опытах на животных.

Исследуемый материал и его обработка. С целью выделения вируса берут фекалии больных и виру-соносителей, и реже, в первые дни болезни, носоглоточные смывы. В летальных случаях материалом для исследования служат спинной, продолговатый и головной мозг, содержи-

275

мое и стенки кишечника, внутренние органы и лимфатиче­ские узлы.

Пробы фекалий отбирают в количестве 2—3 г на 1-й не-деле болезни. Их переносят из судна, не содержащего де­зинфицирующих веществ, в пенициллиновые флаконы, ко­торые помещают в термос со льдом. Эти пробы до отправки в лабораторию можно хранить на холоде не более 1—2 дней.

Из фекалий готовят 20% суспензию в дистиллированной воде, которую центрифугируют при 3000 об/мин 30 минут. Надосадочную жидкость отделяют градуированной пипет­кой и к ней добавляют антибиотики из расчета 1000 ЕД/мл пенициллина, 500 ЕД/мл стрептомицина и 20 ЕД/мл ниста­тина и оставляют на 1—2 часа при комнатной температуре. Взвесь разливают в ампулы или маленькие пробирки с ре­зиновыми пробками и делают посев на стерильность. Про­бы хранят в замороженном состоянии при —20°.

Носоглоточную слизь берут сухим ватным тампоном, по­сле чего палочку отламывают на уровне ваты и тампон помещают в пенициллиновый флакон. Для полоскания гор­ла используют 10 мл 0,85% раствора NaCl или раствор Хенкса, полученный смыв наливают на ²/з во флакон с там­поном. Тампон отжимают, жидкость центрифугируют, до­бавляют антибиотики и хранят в замороженном состоянии.

Из мозга с помощью указанных растворов приготовляют 10% взвесь, проверяют на стерильность и замораживают. Кусочки мозга и органы, залитые 50% раствором глице­рина, хранят при температуре 4° в течение нескольких ме­сяцев.

Заражение культур тканей. Культивируют по-лиовирус в первично трипсинизированных клетках челове­ческого эмбриона (почки, мышцы, кожа и др.), амниотиче-ской оболочки человеческой плаценты и почечной ткани обезьян (макак резус, макак циномольгус). Широко ис­пользуются также перевиваемые клетки HeLa, Нер-2 и др.

Надосадочной жидкостью фекалий в количестве 0,2—0,3 мл заражают 3—5 пробирок с культурой тканей, в которых обновляется питательная жидкость. После одного часа пребывания пробирок в термостате питательную среду снова заменяют свежей. Носоглоточные смывь^, взвесь из мозга и другой материал вносят в количестве 0,2—0,5 мл в пробирки с культурой ткани. Несколько пробирок для контроля качества клеток оставляют незараженными. За­раженные и контрольные культуры выращивают при темпе­ратуре 37°.

В случае положительного результата дегенерация клеток может наступить в течение 12 дней, которую учитывают при малом увеличении микроскопа. Степень дегенерации услов­но обозначается плюсами. Незначительное количество изме­ненных клеток обозначают ± или +, наличие половины дегенерированных клеток оценивается знаком ++, ³Л из­мененных клеток + + + и при дегенерации всех клеток

_{_ _1_ _j_ Культуральную жидкость сохраняют в заморо­женном виде, ее используют для типирования и титрования вируса.

Титрование вируса по методу б л я ш е к про­изводят в однослойных культурах, выращенных во флако­нах и залитых агаровой смесью с красителем нейтральным красным. Вирус разводят так, чтобы в 0,1 мл содержалось около 20—60 бляшкообразующих единиц. Заражают 2 фла­кона, в каждый вводят по 0,1 мл полученного разведения. Флаконы оставляют на час при комнатной температуре, а затем заливают специальной агаровой смесью. После за­стывания их инкубируют при 37°, подсчет бляшек произво­дят на 2—5-е сутки. Они представляют собой бесцветные участки культуры, образование которых связано с гибелью клеток под влиянием вируса. Вычисляют среднее количество бляшек в одном флаконе. Логарифм этого числа прибавля­ют к показателю степени разведения вируса, использован­ного для заражения, и получают титр вируса в том объеме, в котором он вводился в каждый флакон.

Идентификацию выделенных вирусов проводят с приме­нением реакции нейтрализации. Вирусную жидкость цель­ную или разведенную 1 : 10 и 1 : 100 смешивают с равным количеством каждой из трех типоспецифических сыворо­ток полиомиелита, разведенных по рабочему титру. Смесь вируса и сыворотки выдерживают при комнатной темпера­туре до часа, после чего добавляют по 0,2 мл каждой сме­си в 2—3 пробирки с культурой ткани. После 30—60 минут контакта вируса с клетками в пробирки прибавляют по 1,8 мл питательной жидкости. В одни контрольные пробир­ки вводят только сыворотки, в другие вирус, для контроля ткани оставляют исходных 4—5 пробирок. В пробирках со смесью вируса и соответствующей гомологичной сыворот­кой, а также в контрольных пробирках с сыворотками в те­чение 12 дней наблюдения клетки не изменяются. В куль­туре ткани со смесями вируса и гетерологических сыворо­ток, а также в контрольных пробирках с вирусами дегене­рация клеток наступает на 3—6-й день. Тип вируса уста-

276

277

навливают по типу иммунной сыворотки, нейтрализовавшей его.

Имея в виду регулярную иммунизацию населения живой нероральной вакциной, каждый выделенный штамм полно-вируса дифференцируют с вакцинными штаммами соответ­ствующего иммунологического типа.

Серологические методы исследования ис­пользуют для выявления нарастания специфических анти­тел в крови переболевших людей. С этой целью применяют реакции нейтрализации в культурах тканей, связывания комплемента, преципитации, а также цветную реакцию. Кровь берут в острой стадии болезни и в стадии реконва-лесценции. При положительном результате выявляют 4-крат­ное нарастание титра антител.

Реакция нейтрализации по цитопатическо-м у д е й с т в и ю. Стандартную концентрацию вируса, чаще 100 цитопатических доз, смешивают с равными объемами нескольких разведений испытуемых сывороток, выдержива­ют при комнатной температуре в течение 1—3 часов. Каж­дую смесь вводят по 0,2 мл в пробирку с культурой ^ткани. Для контроля заражают ткань смесью вируса с типоспеци-фической и нормальной сыворотками. 5—10 пробирок с культурой ткани оставляют незараженными (контроль тка­ни). Наблюдения проводят 7 дней. Титром вируснейтрали-зующих антител считают то наибольшее разведение сыво­ротки, которое подавляет цитопатическое действие вируса на ткани.

Цветная реакция основана на изменении красного цвета питательной среды, содержащей индикатор феноло­вый красный рН 7,4—7,8. В культурах тканей, не заражен­ных вирусом, под влиянием продуктов метаболизма клеток реакция среды изменяется в кислую сторону (рН 7) и среда приобретает оранжево-розовый, а затем желтый цвет. Если клетки культуры ткани инфицируются вирусом и погибают, цвет питательной среды остается неизмененным — красным. В опыте титрования антител с помощью цветной реакции применяют перевиваемые клетки человеческого амниона. Сыворотку больного разводят 1:10— 1:640 питательной средой, содержащей индикатор феноловый красный. В каж­дый ряд пробирок с сывороткой вводят по 100 цитопатиче­ских доз одного из типов вируса и взвесь клеток HeLa. Про­бирки заливают вазелиновым маслом и ставят в термостат при 36—37°. Учет изменений рН производят на 5—7-е сутки путем сравнения цвета среды в опытных и контрольных про-­

	Контроль	сыворотки	к	0,25 1:10 0,25 0,25
		вируса |	« об	0,25 0,25 0,25
Схема постановки опыта титрования антител с помощью цветной реакции	к г^-			0,25 1 : 640 0,25 0,25
	05 со			0,25 1:320 0,25 0,25
	W ю			0,25 1 : 160 0,25 0,25
	4-я			0,25 1 : 80 0,25 0,25 -7 дней.
	СО			0,25 1:40 0,25 0,25 эстат на 4—
	К (N			0,25 1:20 0,25 0,25 нот в терме
				0,25 1 : 10 0,25 0,25 . рки помеще
	Я / М / О. / К / \о / о / сх / с / / 2 / к / w / о. и / кw / s			Сыворотка больного (различные разведе­ния) Питательная среда Вирус одного из типов, по 100 ЦПД50 Взвесь клеток (300 000— 400 000) в 1 мл Примечание. Проби

278

бирках со стандартными со буферными растворами рН от 6,4 до 8, содержа­щими феноловый крас­ный в той же концентра­ции (табл. 32).

Титром сыворотки яв­ляется наибольшее ее разведение, которое пол­ностью нейтрализует ви­рус (последняя пробирка с размножающейся тка­нью, среда окрашена в желтый цвет).

Реакция связы­вания комплемен-т а. Кровь у больных для получения сыворотки бе­рут в первые дни болезни и второй раз — через 3—4 недели. В реакции используется три типо­вых антигена, их полу­чают путем ультрацен­трифугирования жидко­сти, зараженной культу­рой ткани. Методика постановки реакции обыч­ная, ставят ее на хо­лоде.

Реакция микропреци­питации в геле (см. стр. 147). Преципитины в кро­ви больных появляются рано и максимальных ти­тров они достигают на 2-й неделе болезни. С целью их выявления ис­следуют две пробы сыво­роток, в начале болезни и спустя 7—14 дней. Сы­воротки предварительно прогревают в водяной ба­не при 56° 30 минут.

Преципитирующая активность антигенов определяется титрованием со стандартными гипериммунными сыворотка­ми обезьян. В реакциях используются антигены, которые со­держат не менее 2 единиц преципитиногена в объеме 0,02 мл. Сохраняются они при —20° до 3 лет и несколько месяцев при +4°.