Задания

1. Серологический диагноз сыпного тифа и болезни Брил-ля: а) постановка реакции агглютинации риккетсий Прова­чека; б) постановка нелрямой реакции гемагглютинации (демонстрация); в) учет реакции связывания комплемента.

2. Приготовление мазков из сыпнотифозной вакцины и окраска их по Здродовскому. »

3. Изучение препаратов, применяемых с профилактиче­ской целью.

Лабораторная диагностика вирусных инфекций

Последовательность и методики исследований вирусных инфекций в данном руководстве даются только для опре­деленной группы болезней с учетом их эпидемиологической значимости и современной вооруженности вирусологических лабораторий.

Диагностику вирусных болезней производят с помощью вирусоскопии, выделения возбудителя, заражения живот­ные и серологических реакций.

Материал для обнаружения и выделения вируса отбирают в зависимости от локализации возбуди­теля и вызываемых им поражений. При нейротропных ин­фекциях исследуют спинномозговую жидкость и кровь больного. Пневмотропные вирусы содержатся в больших количествах в отделяемом верхних дыхательных путей, мокроте, носоглоточных смывах, энтеровирусы — в испраж­-

нениях. Содержимое пустул, везикул, участки пораженной кожи или слизистой оболочки служат для выделения дер-мотропных вирусов. У трупов исследованию подлежат кровь, кусочки головного и спинного мозга, легких, брон­хов, соскоб со слизистой оболочки носоглотки.

Исходным материалом, не содержащим бактерий (кровь, спинномозговая жидкость), непосредственно заражают эм­брионы, культуру тканей или животных. Испражнения, мо­чу и другие выделения перед введением обрабатывают ан­тибиотиками.

Лабораторная диагностика гриппа

Особенностью гриппа является внезапное и весьма быст­рое распространение инфекции, охватывающей большие массы населения. В связи с этим грипп во время эпидемий распознается легко. Диагностика гриппа в межэпидемиче­ский период является весьма затруднительной, так как он протекает сходно со многими инфекционными болезнями. Особенно трудно дифференцировать клинически грипп и острые катары дыхательных путей. Этот вопрос разрешает­ся только при помощи лабораторных исследований. Наличие нескольких серологических типов гриппозных и парагрип-позных вирусов усложняет диагностику.

В настоящее время вирусологические лаборатории широ­ко используют относительно ранние методы лабораторной диагностики гриппа (ответ выдают через 2—3 дня): выде­ление штаммов вируса гриппа в развивающемся курином эмбрионе и риноцитологические исследования. С целью рет­роспективной диагностики изучают парные сыворотки боль­ною, взятых в острый период болезни и после выздоров­ления.

Для лабораторных исследований используют отделяемое носоглотки, носовой секрет, препараты — отпечатки слизи­стой оболочки носа, сывори.ху крови больного. В случаях с летальным исходом — секционный материал.

Взятие материала. Носовые ходы (на 1—2-й день болезни) протирают ватным тампоном, который помещают в пробирку с 3 мл раствора Хенкса. Больной предвари­тельно полощет рот кипяченой водой, затем прополаскивает горло 10 мл раствора Хенкса, полоскательный смыв со­бирают в пробирку с тампоном, которую обкладывают льдом и немедленно направляют в лабораторию. После оттаивания тампоны отмывают, смывы фильтруют через

264

265

марлевый фильтр и концентрируют в 10—20 раз. Для этого к 10 мл осветленного смыва добавляют 1 мл 5% стерильной троекратно отмытой взвеси эритроцитов. Смесь помещают в холодильник на час, центрифугируют в течение 5 минут и удаляют надосадочную жидкость. К 1 мл осадка для по­давления бактериальной флоры прибавляют по 20 ЕД пе­нициллина и стрептомицина.

Сыворотку крови исследуют двукратно в первые дни бо­лезни и в период реконвалесценции (на 12—14-й день от начала заболевания). Сыворотку прогревают при 60° 30 минут и сохраняют на холоде. Для исследования секцион­ного материала от трупа берут отрезок бронхов, трахеи, 2—3 кусочка легкого, кровь из сердца.

Выделение и идентификация вируса грип­па в развивающемся курином эмбрионе. Но­соглоточным смывом, обработанным антибиотиками, зара­жают 10—12-дневные куриные эмбрионы. Смыв, получен­ный от одного больного, вводят в объеме 0,1—0,2 мл в амниотическую полость 4—5 эмбрионов. Культивирование производят при температуре 35—36° в продолжение 2 суток. Эмбрионы помещают на сутки в холодильник при 4°, затем вскрывают, отсасывают последовательно аллантоисную и амниотическую жидкости и при помощи реакции гемагглю­тинации или связывания комплемента обнаруживают ви­рус. Тип вируса определяют реакцией задержки гемагглю­тинации. С целью адаптации вируса к развивающемуся эм­бриону проводят по 4—5 пассажей.

Выделение и идентификацию вируса грип­па от б о л ь н ы х производят также заражением смывами первично трипсинизированных эмбриональных тканей почек человека или обезьян. После 2—3-дневной инкубации в тер­мостате к культурам добавляют взвесь отмытых куриных эритроцитов (метод гемадсорбции, рис. 91), которые фик­сируются на поверхности эпителиальных клеток, содержа­щих вирус, островками в виде гроздьев, розеток, цепей. До­бавление типоспецифической сыворотки устраняет гемад-сорбцию, что дает возможность быстро идентифицировать тип вируса в культуре ткани.

Риноцитологические исследования. При ис­следовании отпечатков слизистой оболочки носа можно диф­ференцировать характер поражения мерцательного цилинд­рического эпителия верхних дыхательных путей при вирус­ном гриппе и острых катарах. У больного получают отпечатки с нижней носовой раковины на специальных

с теклах из плексигласа с закругленными концами размером БхЮО мм и толщиной 1,5 мм. Наиболее удобно брать от­печатки с помощью лобного рефлектора и носорасширителя. Препарат высушивают на воздухе и окрашивают 1—2 ми­нуты по Романовско­му— Гимзе неразве-ценным красителем, который смывают за­тем дистиллированной водой. После высуши­вания препарат изуча­ют иммерсионной си­стемой.

При гриппе обнару­живают в большом ко­личестве слущенные дегенеративно изме­ненные, лишенные рес­ничек клетки цилинд­рического эпителия, включения вируса, ок­рашенные в фиолето­вый цвет и дегенери-рованные формы лей­коцитов. Включения вируса гриппа можно обнаружить и в про­дромальном периоде болезни. При острых катарах верхних ды­хательных путей в от­печатках преобладают нейтрофилы и единичные мало изме­ненные клетки цилиндрического эпителия. Включения, как правило, отсутствуют.

Обнаружение вирусных включений мето­дом люминесцентной микроскопии. Мазки-от­печатки, полученные описанным выше способом, окрашива­ют раствором акридин оранжевого и просматривают в люминесцентном микроскопе в видимо¹¹* сине-фиолетовом свете. Включения вируса гриппа в цитоплазме клеток имеют вид ярко-красных четко отграниченных гранул. Цитоплаз­ма клеток светится тускло-красным светом, ядра клеток — изумрудно-зеленым. Свечение зависит от характера и ко­личества кислот (рибонуклеиновая кислота вируса гриппа

267

266

,светится от тускло-красного до ярко-красного света, дезок-сирибонуклеиновая кислота аденовирусов — изумрудно-зе­леным светом).

В цитоплазме эпителия носовых раковин обычно встре­чаются 1—2 вирусных включения небольшой величины.

Для исследования парных сывороток приме­няют реакцию торможения гемагглютинации, реакцию свя­зывания комплемента на холоде и нейтрализации в биологи­ческих опытах. Эти реакции изучают в динамике.

Первый раз кровь берут в начале болезни, но не позднее 6-го дня, второй раз — в период выздоровления на 14-й день и позже. Сыворотки прогревают 30 минут при 58° для устранения комплемента и антикомплементарных свойств и удаления неспецифических ингибиторов вируса, центрифу­гируют и отделяют от осадка. Парные сыворотки во всех указанных реакциях исследуются одновременно.

Реакция гемагглютинации и торможения гемагглютинации. Реакцию гемагглютинации исполь­зуют с целью ориентировочного выявления вируса в инфи­цированном материале (куриные эмбрионы, легкие мышей, культура тканей) и для титрования вируса.

Ориентировочную реакцию гемагглютинации ставят на предметном стекле. Каплю 5% взвеси эритроцитов и каплю аллантоисной жидкости куриного эмбриона или другого ви-руссодержащего материала тщательно смешивают на стеб­ле. При положительной реакции эритроциты агглютиниру­ются и выпадают в виде хлопьев (рис. 92, /).

Д ля определения титра вируса используют доски из плек­сигласа. Материал, содержащий вирус, разводят последо­вательно (табл. 29).

) типа	диагности кума	10-я	0,25 0,25 | 0,5
	сыворотки	се	Is 10 0,25 0,25 | 0,5
[ОМ одногс	к 00		Ы280 0,25 0,25 | 0,5
Схема постановки РТГА с сывороткой больного гриппом и диагностику*			о -rfi lO LO vO CO CN CM 1 Z oo 1 о
	« CD		о (M tO LO w-5 CO CN CM 1 i ^ о о ^
	« LO		1 : 160 0,25 0,25 1 0,5
	к		Zoo1 °
	3-я		Zoo1 °
	2-я		1 : 20 0,25 0,25 минут 1 0,5 ) МИН)7!
	1-я		1:10 0,25 0,25 2 на 5 1 0,5 e на M
	I a i Й / >» / 4 / / ^ / 2 / vS / 2 / я / ф / я / 4 / <и / с / 3 / s		Сыворотка, предварительно разве­денная . др, Диагностикумом гриппа Аг (4Ae,j 0,85% раствор NaCl Оставляют при комнатной температур» 1% взвесь куриных эритроцитов Оставляют при комнатной температур

Из 1-й лунки после ^ перемешивания пере- ее носят 0,5 мл жидкости * во 2-ю и так делают ч разведения до 1 : 160, ^ из 5-й лунки, после пе- ь ремешивания, 0,5 мл выливают в банку с дезинфицирующим ра­створом. В каждую лунку вносят по 0,5 мл 1 % взвеси эритроцитов курицы. Учет реакции гемагглютинации про­изводят, как обычно, по характеру осадка эритроцитов.

Реакция торможе­ния гемагглютинации (табл. 30) связана со способностью иммун­ных типовых сыворо­ток и сывороток боль­ных гриппом нейтрали­зовать гем агглютини­рующую активность вируса (рис. 92, 2). С целью определения типа вируса применя­ют типовые сыворотки, для определения анти­тел — антигемагглюти-нинов используют ти­повые диагностикумы.

Антигены должны обладать авидностью, т. е. способностью вы­зывать выработку ан-тигемагглютининов в высоком титре и жад­но вступать в реакцию с иммунными сыворот­ками, а также быть ус­тойчивыми к ингибито-

рам сыворотки находящимся в сыворотках человека и жи­вотных в виде неспецифических антигемагглютининов, пре­пятствующих взаимодействию антигена с истинными анти-гемагглютининами. Термолабильные ингибиторы устраняют прогреванием сыворотки при 56° в течение 30 минут, тер­мостабильные—перйодатом калия, фильтратом бульонной культуры холерного вибриона или каолином.

Один объем 0,05 М перйодата (1,15 г КЮ₄) растворяют е 100 мл дистиллированной воды, добавляют к одному объе­му неразведенной, прогретой сыворотки. Фильтрат бульон­ной культуры холерного вибриона в количестве 9 объемов добавляют к одному объему прогретой сыворотки. При ис­пользовании каолина к 0,2 мл сыворотки добавляют 0,8 мл 0,85% раствора NaCl и 1 мл 25% взвеси каолина в изотоническом растворе. Смесь встряхивают, центрифу­гируют и для реакции используют надосадочную жид­кость.

Техника постановки РТГА с целью опре­деления антигемагглютининов. Вирусный диаг­ностикум или живой вирус титруют с 2% взвесью отмытых куриных эритроцитов для определения гемагглютинирую-щей единицы.

Сыворотку разводят 0,85% раствором NaCl 1 : 10 и в дальнейшем производят последовательно двукратные раз­ведения (от 1 : 10 до 1 : 1280) в объеме 0,25 мл. Количестве рядов пробирок зависит от количества введенных в опыт типов вируса гриппа. К каждому разведению сыворотки острого периода болезни и в период реконвалесценции при­бавляют 0,25 мл взвеси вируса, содержащей 4 гемагглюти-нирующие единицы. Смесь сыворотки с вирусом встряхива­ют, оставляют на 5 минут при комнатной температуре, после добавляют 0,5 мл 1% взвеси куриных эритроцитов, снова встряхивают и оставляют при той же температуре. Резуль­таты реакции учитывают через 45 минут.

Наибольшее разведение сыворотки, которое еще тормо­зит реакцию агглютинации эритроцитов, является титром сыворотки. Разница между соответствующими рядами про­бирок указывает на увеличение антител.

Основной опыт РСК (табл. 31) ставят с четырьмя анти­генами гриппа A, Ai, А₂ и В. Перед постановкой опыта ан­тигены разводят 0,85% раствором хлористого натрия до титра, для реакции берут половину этой дозы. Если титр антигена измеряется 0,01, то рабочей дозой является 0,005 мл.

Сыворотки больных (до 6-го дня болезни) и переболев­ших (от 14 до 30-го дня от начала заболевания) инактиви-руют, разводят 1 : 10, 1 : 20 и 1 : 40 и разливают по 0,5 мл в пробирки.

Штативы с пробирками встряхивают и ставят в холодиль­ник при температуре от 0 до 4°. Через сутки их переносят из холодильника в условия комнатной температуры на час, затем в каждую пробирку прибавляют по 1 мл гемолитиче­ской системы и пробирки помещают в термостат при 37° на час. Результаты оценивают, как обычно, плюсами. Диагно­стическое значение имеет увеличение количества антител в поздней сыворотке не менее чем в 4 раза по сравнению с ранней. Нарастание антител значительно снижено у ма­леньких детей в связи с пониженной иммунологической ре­активностью.

Реакция нeйtpaлизaции позволяет обнаружить в сыворотках переболевших гриппом людей антитела, ней­трализующие вирус гриппа. Используется она в двух ва­риантах: к равным объемам одного и того же разведения сыворотки приливают возрастающие разведения вируса или к равным объемам- разных разведений сыворотки прибав­ляют постоянную дозу вируса. Ставят эту реакцию чаще на куриных эмбрионах.

Вирус в реакции нейтрализации титруют для определения инфекционной дозы. Титром сыворотки вируса считают то наибольшее разведение, которое вызывает цитопатическое действие у 50% зараженных куриных эмбрионов или куль­тур тканей, выражают его количеством цитопатических доз (ЦД₅о) в 1 мл. Сыворотки, исследуемые на наличие анти­тел, прогревают для освобождения от термолабильных ин­гибиторов. При постановке реакции с вирусом гриппа А₂ ее

270

освобождают и от термостабильных ингибиторов. Затем ис­пытуемую сыворотку, разведенную 1 : 10, разливают по 0,2 мл в ряд пробирок. В каждую пробирку прибавляют 0,2 мл аллантоисной или амниотической жидкости, содер­жащей вирус гриппа в разведениях от 1 : 10 до титра вируса и пенициллин из расчета 100 ЕД на 1 мл смеси. Пробирки со смесью выдерживают при комнатной температуре 30 ми­нут, после чего заражают эмбрионы. Контролем являются эмбрионы, зараженные теми же разведениями вируса в сме­си с изотоническим раствором. Через 72 часа яйца вскрыва­ют, ставят реакцию гемагглютинации с аллантоисной жид­костью опытных и контрольных эмбрионов и устанавливают нейтрализирующую способность сыворотки.

При постановке опыта нейтрализации с различными раз­ведениями сыворотки и постоянной дозой вируса берут 100 или 1000 инфекционных доз.

Задания

1. Вскрытие куриного эмбриона, зараженного вирусом гриппа.

2. Учет реакции торможения гемагглютинации.

3. Демонстрация реакции гемадсорбции вируса гриппа. Щ 4. Постановка реакции связывания комплемента с парны- ми сыворотками. .

5. Изучение препаратов, применяемых с профилактиче­ской и лечебной целью против гриппа.

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА НАТУРАЛЬНОЙ ОСПЫ

Возбудитель болезни — Poxvirus variolae.

Материалом для исследования является содержимое па­пул, везикул и пустул, чешуйки и корки, отделяемое слизи­стой оболочки носа и носоглотки, кровь.

С диагностической целью применяются вирусоскопич. ские, биологические и серологические исследования.

Вирусоскопическое исследование. Для обна­ружения вируса оспы из содержимого везикул и пустул приготовляют мазки и окрашивают серебрением по методу Морозова (см. стр. 40). Возбудитель оспы имеет вид мелких точечных образований черного цвета, расположенных оди­ночно, парами, короткими цепочками и скоплениями. Па­раллельно используют биологический метод исследования: проводят заражение куриных эмбрионов и культуры тканей.

272

271

Выделение вируса на куриных эмбрионах. Содержимое везикул и пустул разводят в 2—10 раз изото­ническим раствором хлористого натрия; соскобы, корки, че­шуйки— в 5—10 раз, их предварительно растирают в ступ­ке, полученную взвесь центрифугируют. Для выявления вируса из крови больного отделяют сыворотку, сгусток рас­тирают с добавлением дистиллированной воды и раздельно производят заражение. В исследуемые пробы добавляют пенициллин и стрептомицин из расчета 500 ЕД/мл, в кровь и везикулярную жидкость — 200 ЕД/мл пенициллина. Ма­териал в количестве 0,1—0,2 мл наносят на хорионаллан­тоисную оболочку 3—6—12-дневных куриных эмбрионов. Инкубируют эмбрионы при 35°. Через 2—3 дня на хорион-аллантоисе появляются специфические изменения в виде точечных белых возвышающихся резко отграниченных пора­жений оболочки. Материал от больных ветряной оспой не вызывает никаких изменений.

Для выделения вируса оспы используют первичные куль­туры кожно-мышечной ткани эмбриона человека и клетки почек обезьян, из перевиваемых клеток — амниотическую ткань человека. Заражают 3—6 пробирок с культурой тка­ни и инкубируют при 36° в течение недели. Очаги дегенера­ции появляются через 24—96 часов. Пораженные клетки округляются и увеличиваются в размере; в цитоплазме на­блюдается зернистость. Цитопатическое действие, вызван­ное вирусом ветряной оспы, имеет мелкоочаговый звездча­тый характер. Реакция гемадсорбции позволяет обнаружить вирус при неясно выраженных дегенеративных изменениях в ткани. Эритроциты адсорбируются на поверхности инфи­цированных клеток, некоторые из них окружаются ими в ви­де ожерелья. Вирус ветряной оспы дает гемадсорбцию дру­гого характера.

Обнаружение телец Гуарниери (рис. 93) производят пу­тем заражения культуры ткани. Клетки выращивают на стеклянных пластинках, помещенных в пробирки. Через Ю—72 часа после заражения культуры материалом от боль­ных пластинки извлекают и окрашивают специальным методом. Включения и цитоплазма приобретают сиреневато-розовый или ярко-розовый цвет. Включения имеют округ­лую или овальную форму, плотную, иногда зернистую кон­систенцию.

При обработке зараженной культуры ткани флюоресци­рующими антителами в положительных случаях через 6 ча­сов появляются очаги свечения.

273

С ерологические исследования. Для диагности­ки оспы на более поздних стадиях заболевания применяют следующие реакции: связывания комплемента, торможения гемагглютинации, микропреципитации в геле и нейтрализа­ции.

больных натуральной оспой можно обнаружить антигемаг-глютинины до появления сыпи, к концу 1-й недели заболе­вания титр их достигает 1 : 2000, а наибольшие концентра­ции появляются к 12—15-му дню. При невысоких титрах в начале болезни исследование повторяют. Эти реакции яв­ляются специфическими и при ветряной оспе дают отрица­тельный результат.

Реакция микропреципитации в геле (экспресс-диагности­ка) основана на взаимодействии антигена со специфической сывороткой (см. стр. 147). С этой целью используют анти­вакцинную сыворотку, нормальную кроличью сыворотку, известный оспенный и испытуемый антигены. Результаты учитывают через 4—24 часа.

Нейтрализующие антитела определяют в культуре тканей или курином эмбрионе, зараженных вирусом, обработан­ным сывороткой больного в течение 2 часов при 37°. Учету подлежат титры антител в разведении более чем 1 : 100.