Лабораторная диагностика туберкулеза

Возбудители туберкулеза — Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis.

Лабораторная диагностика туберкулеза включает бакте-риоскопический и бактериологический методы исследования, проведение биологической пробы и аллергических реакций. Предложены также серологические реакции, но практиче­ского применения они не нашли.

Материалом для микроскопического, бактериологическо­го исследований и биопробы, в зависимости от локализа­ции процесса, служат мокрота, гной, спинномозговая жид­кость, моча, испражнения, которые собирают в стерильную посуду (мокроту в баночки, спинномозговую жидкость и другие материалы в прибирки).

Бактериоскопическое исследование. Мок­роту выливают в чашку Петри, ставят на черную поверх­ность стола, выбирают гнойные комочки, наносят их на предметное стекло и растирают между двумя стеклами. Спинномозговую жидкость оставляют на холоде. Через 18— 24 часа образуется нежная сетка фибрина. В ней находятся микобактерий туберкулеза и клеточные элементы, захвачен­ные во время свертывания. Эту пленку осторожно распре­деляют на предметном стекле. Мочу центрифугируют и де­лают мазки из осадка.

Мазки окрашивают по Цилю — Нильсену (стр. 27). Ту­беркулезные микобактерий окрашиваются в ярко-красный (рубиновый) цвет, они имеют вид тонких, длинных, слегка изогнутых или коротких, прямых, палочек, в них иногда об­наруживается зернистость. Микобактерий располагаются поодиночке или неправильными группами (см. рис. 12, 2). При окраске осадка мочи следует производить обесцвечи­вание не только серной кислотой, но и спиртом, так как в моче могут присутствовать непатогенные кислотоустойчивые микобактерий смегмы (Mycobacterium smegmatis). В отли­чие от микобактерий туберкулеза они обесцвечиваются спир­том. Если в материале находится небольшое количество ми­кобактерий и в обычных мазках их нельзя обнаружить, применяют методы обогащения.

Метод гомогенизации. Суточную порцию мокроты выливают во флакон или банку, добавляют равный объем 1% водного раствора едкого натра, плотно закрывают ре­зиновой пробкой и энергично встряхивают до полной гомо-

243

генизации (10—15 минут). Мокроту, утратившую вязкость, центрифугируют, жидкость сливают, осадок нейтрализуют добавлением 2—3 капель 10% раствора соляной или 30% раствора уксусной кислоты. Из осадка готовят мазки и ок­рашивают по Цилю — Нильсену.

Метод флотации. Суточную или двухсуточную пор­цию мокроты гомогенизируют обычным способом. Для того чтобы не осталось слизистых комочков, банку с гомогени­зированной мокротой помещают на 30 минут в водяную ба­ню при 55°. Затем добавляют 1—2 мл ксилола (можно вме­сто ксилола добавить бензол, бензин, петролейный эфир и т. п.) и встряхивают в течение 10 минут, а затем отстаи­вают 20 минут при комнатной температуре. Капельки кси­лола с адсорбированными микробами всплывают, образуя сливкообразный слой, его снимают пипеткой и наносят на предметное стекло, помещенное на стеклянную пластинку, нагретую над водяной баней до 60°. Высохший мазок покры­вают новой порцией сливкообразного слоя, и так до тех пор, пока будет перенесен на стекло весь флотационный слой. Препарат фиксируют и окрашивают по Цилю — Ниль­сену.

В настоящее время в качестве быстрой диагностики ту­беркулеза применяют люминесцентную микроскопию. Этот метод увеличивает количество положительных результатов. Препарат окрашивают аурамином в разведении 1 : 1000, после чего обесцвечивают солянокислым спиртом и докра­шивают кислым фуксином, который «гасит» свечение элементов тканей, слизи в препарате. Микобактерий ту­беркулеза светятся золотисто-зеленым светом на темном фоне.

Бактериологический метод является более эф­фективным и применяется в тех случаях, когда бактерио-скопическое исследование не дало положительных резуль­татов.

К исследуемому материалу добавляют двойной объем 6% раствора серной кислоты (которая убивает кислотоподат-ливые микробы), встряхивают в течение 10 минут. Затем центрифугируют в стерильной пробирке, жидкость сливают, осадок нейтрализуют добавлением 1—2 капель 3% раствора едкого натра или отмывают несколько раз изотоническим раствором и сеют. Фекалии обрабатывают 4% раствором едкого натра, смесь помещают в термостат на 3 часа, цен­трифугируют и осадок нейтрализуют 8% раствором соля­ной кислоты, после чего сеют в специальные среды.

244

и окрашивают по Цилкэ— Нильсену. Микроколоний в пре­парате имеют вид жгутов (кос). Максимальный рост по­является к 7—10-му дню.

Глубинный рост в гемолизированной крови (метод Школьниковой). В пробирки с цитратной кровью сеют те же выделения, обработанные серной кисло­той и промытые изотоническим раствором. Через 6—8 дней пребывания в термостате среду центрифугируют и из осад­ка делают мазки.

Биологический метод является наиболее чувстви­тельным и дает положительные результаты при введении морской свинке минимальных количеств (единичных) ми­кобактерий туберкулеза. Патологический материал, обра­ботанный серной кислотой и освобожденный от посторонней микрофлоры, вводят в количестве 2—3 мл подкожно в об­ласть паха. При положительном результате через 6—10 дней в месте введения возникает инфильтрат, образуется густой гной, в котором можно обнаружить микобактерий тубер­кулеза. В дальнейшем животное теряет в весе и через 6— 12 недель погибает. При вскрытии выявляются бугорки в органах, в мазках из них находят микобактерий туберку­леза. Если морская свинка не погибает, ее забивают, затем вскрывают и тщательно изучают макро- и микроскопически внутренние органы. Только после такого исследования вы­дают отрицательный результат.

Аллергический метод применяют главным обра­зом для определения инфицирования микобактериями ту­беркулеза. Положительная аллергическая реакция на вве­дение туберкулина подтверждает заражение туберкулезом, но не характер процесса. Эту реакцию применяют в диаг­ностике туберкулеза у детей, кроме того, перед вакцина­цией наряду с клиническими исследованиями ставят обя­зательно и аллергические реакции: кожную пробу Пирке и внутрикожную Манту. Техника проведения этих реакций описана в общей части (см. стр. 176—177).

Серологический метод. Реакцию связывания ком­племента Борде — Жангу для диагностики туберкулеза при­меняют редко. Чаще используют непрямую реакцию гемаг­глютинации Мидлбрука — Дюбо. В качестве антигена берут сенсибилизированные эритроциты. Обработанные та­нином эритроциты барана или человека О-группы смеши­вают с экстрактом микобактерий туберкулеза или очищен­ным туберкулином (0,5 мл осадка эритроцитов и 10 мл экстракта), выдерживают 2 часа при 37° и отмывают на

246

1.Глицериновый картофель по Павловскому. Кар» гофель очищают и кладут в 1 % раствор сулемы на 30 минут, промывают 12 часов в проточной воде, вырезают цилиндры, разделяют их по диаго­нали. Косо срезанный картофель помещают в пробиэку с перетяжкой в нижней части (пробирка Ру); на дно пробирки наливают 1 мл 5% раст­вора глицерина и стерилизуют.

2.Среда Петраньяни. К 150 мл цельного молока добавляют, помешивая, 6 г картофельного крахмала, 1 г пептона и один мелко на­резанный клубень картофеля величиной с куриное яйцо. Смесь нагрева­ют до образования клейстера, охлаждают до 50°, после чего добавляют 4 куриных яйца и один желток, перемешивают, вливают 12 мл глицерина и 10 мл 2% раствора малахитового зеленого, фильтруют через марлевый фильтр, разливают по пробиркам и свертывают в наклонном положенил при 85° в течение 2^]/₂ часов.

3.Синтетическая среда Сотона. В 200 мл дистиллирован­ной воды растворяют при подогревании 4 г аспарагина, 2 г лимонной кислоты, 0,5 г лимонного аммиачного железа, 0,5 г сернокислой магне­зии, 0,5 г двуосновного фосфорнокислого калия, 60 г глицерина, фильт­руют, наливают 800 мл дистиллированной воды, устанавливают рН 7,2,, добавляя аммиак, разливают по колбам и стерилизуют 20 минут при 115°. Для предупреждения высыхания пробки пробирок с питательными средами заливают парафином.

Такие материалы, как спинномозговая жидкость, экссу­дат, гной, кровь предварительной обработке не подверга­ются, их наносят пипеткой на питательную среду, затем платиновой петлей тщательно втирают, распределяя по всей поверхности среды. Ватные пробки заливают парафи­ном (во избежание высыхания), посевы помещают в термо­стат при 37° и выдерживают в течение 6—8 недель. Рост появляется на 10—30-й день в виде отдельных колоний, зна­чительно возвышающихся над поверхностью среды, морщи­нистых, суховатых, с неровными краями. При отсутствии роста через 6 недель делают соскоб с поверхности среды и проверяют микроскопически на наличие кислотоустойчивых бактерий.

Ускоренные методы бактериологической диагностики ту­беркулеза. Метод микрокультур (метод Прайса). Мокроту, гной, осадок мочи наносят толстым слоем на не­сколько стерильных предметных стекол. Высушенный пре­парат берут стерильным пинцетом и погружают на 5 минут в 6% раствор серной кислоты, затем —в стерильный изо­тонический раствор для удаления кислоты. После этого препараты помещают во флаконы с цитратной кровью (к 10 мл крови кролика или барана добавляют 2 мл 5% раствора цитрата натрия, разводят 1:4 дистиллированной водой и разливают в пробирки). Посевы ставят в термостат. Через 48—72 часа предметное стекло извлекают, фиксируют

245

центрифуге для удаления избытка антигена. Сыворотку больного до опыта истощают взвесью эритроцитов, не об­работанных антигеном, для устранения неспецифической реакции. Исследуемую сыворотку разводят, начиная с 1 :2, 1:4, 1:8 и далее. Диагностическое значение имеет поло­жительная реакция в разведении 1:8. Положительные ре­зультаты регистрируются у 70—90% больных туберкулезом.

Лабораторная диагностика лепры

Возбудитель лепры — Mycobacterium leprae. Основным методом диагностики является бактериоскопическое исследование. При наличии кожных узлов исследуют соскоб (предварительно бритвой срезают эпидермис) с уп­лотненных мест кожи, при легочной лепре — мокроту, при любых других формах — соскоб слизистой оболочки носа. С этой целью в нос глубоко вводят металлическую ложечку и соскабливают слизистую оболочку до появления капли крови.

Мазки окрашивают по Цилю — Нильсену, однако, учиты­вая менее выраженную кислотоустойчивость, обесцвечива­ют 0,5% раствором серной кислоты. Применяют также ок­раску по методу Семеновича — Марциновского (стр. 28). Микобактерий лепры располагаются внутри клеток, запол­няя их. Цитоплазма и ядро этих клеток оттеснены к пери­ферии. В пораженных тканях также находится большое количество микобактерий, расположенных внеклеточно. Группируются они в виде пачек сигар (см. рис. 12, 3), что позволяет дифференцировать их с микобактериями туберку­леза, которые морфологически и тинкториально сходны с воз­будителями лепры. Посев материала на питательные сре­ды для культивирования микобактерий туберкулеза дает отрицательный результат. Морские свинки нечувствительны к возбудителям лепры.

Аллергическую пробу ставят для дифференциации клинических форм лепры. Аллерген — лепромин представ­ляет собой вытяжку из лепрозных узлов, длительно кипя­ченую для уничтожения микобактерий. Вводят его внутри­кожно. Реакция считается положительной, если через 24— 48 часов в месте введения появляется эритема и небольшая папула (ранняя реакция). При переходе в позднюю реак­цию на месте введения аллергена образуется узелок, дости­гающий к концу месяца 1—2 см с некрозом в центре. По-

247

ложительный результат свидетельствует о сопротивляемости организма и типичен для туберкулоидной формы. При леп-роматозной форме реакция отрицательная.