Лабораторная диагностика холеры

Холера —особо опасное инфекционное заболевание, вы­зываемое Vibrio cholerae (Vibrio comma). Лабораторная диагностика имеет большое значение, так как все противо­эпидемические мероприятия проводятся с учетом быстрого выявления возбудителей холеры у больных и носителей.

Лабораторному исследованию подлежат рвотные массы и испражнения. При отсутствии выделений в момент взя­тия у больных материала вырезают загрязненные участки белья. У здоровых людей для исследования на носительство

221

берут испражнения стеклянной трубкой с оплавленными краями, которую вводят в прямую кишку на глубину 5—8 см. После извлечения трубку с фекалиями опускают в колбу с питательной средой. Материал от трупа получают следующим образом: вырезают 3 участка из верхней, сред­ней и нижней части тонкой кишки длиной 10—15 см, с каж­дого конца намеченного участка отжимают содержимое кишки в стороны, накладывают две лигатуры и между ними перерезают кишку. Желчный пузырь отделяют с частью пе­чени.

Обязательному исследованию подлежат вода и пищевые продукты. Воду берут в количестве 1 л, продукты — в коли­честве не менее 200 г.

Материал для исследования собирают, упаковывают и доставляют в лабораторию с соблюдением особых предо­сторожностей. Посуда не должна содержать следов дезин­фицирующих растворов, особенно кислот; стерилизуют ее в автоклаве или кипячением в течение 15 минут. Нельзя ополаскивать посуду некипяченой водой, так как в послед­ней могут находиться холероподобные вибрионы, которые затрудняют исследование.

Банки, пробирки должны быть закрыты стеклянными или резиновыми пробками. При использовании корковых про­бок под них подкладывают пергаментную бумагу. После взятия материала пробки заливают парафином или сургу­чом, обвязывают двойной вощеной бумагой, наклеивают эти­кетку с указанием фамилии больного, характера материала и времени его взятия, предположительного диагноза и фа­милии лица, направляющего пробы. Если лаборатория на­ходится на большом расстоянии, банки, пробирки с мате­риалом для исследования помещают, перекладывая их стружками, в металлическую посуду, которую в свою оче­редь упаковывают в деревянный ящик. Ящик обвязывают, пломбируют, надписывают: «Верх, осторожно» и пересы­лают с нарочным.

Исследование должно производиться в специальной ла­боратории. Однако, если такой лаборатории нет, объекты для исследования направляют в любую бактериологическую лабораторию, имеющую изолированное помещение и от­дельные вход и выход. Прием других анализов в таком слу­чае прекращают и устанавливают более строгий режим. К работе в этих лабораториях допускают лиц, прошедших специальную подготовку, привитых и фагированных против холеры. Персоналу запрещается работать в лаборатории

222

натощак. Работа проводится круглосуточно, так как ре­зультаты исследования должны быть выданы через 30— 36 часов.

Исследование материала от больного. Не­посредственно после поступления в лабораторию фекалий и рвотных масс готовят мазки, окрашивают их по Граму и

Рис. 82. Холерные вибрионы (мазок из испражнений).

микроскопируют. В дальнейшем при лабораторном под­тверждении холеры, хотя бы в одном случае, мазки окра­шивают только фуксином Пфейффера. Холерные вибрионы имеют вид запятых, окрашенных грамотрицательно. В ис­пражнениях они располагаются между тяжами слизи в виде стаек рыб (рис. 82).

Обнаружение типичных форм еще не дает право утверж­дать, что выявлены возбудители холеры, так как холеропо­добные вибрионы морфологически сходны с первыми. Вме­сте с тем истинные холерные вибрионы могут иметь нетипич­ную палочковидную или круто изогнутую форму в виде кольца.

После микроскопического исследования выдают первый предварительный результат. В нем указывают, обнаружены или не обнаружены вибрионы, если обнаружены, то как окрашены по Граму, и отмечают, что исследование продол-

223

жается. Результат подписывает лицо, производившее иссле­дование.

Одновременно с бактериоскопическим проводят бактерио­логическое исследование рвотных и фекальных масс, кото­рые сеют в несколько пробирок и флаконов со щелочной пептонной водой (рН 7,8—8), а также в чашку со щелоч­ным агаром. Холерный вибрион, как облигатный аэробный микроб, размножается быстрее на поверхности среды. Все посевы помещают в термостат при 37°.

Через 5—6 часов исследуют пленку на пептонной воде; для ее обнаружения пробирку или флакон наклоняют, плен­ка прилипает к стенке, она имеет слегка голубоватый цвет. Из пленки или с поверхности среды делают мазки, окраши­вают по Граму, изучают подвижность в препарате «вися­чей» капли, ставят реакцию микроагглютинации с О-холер-ной агглютинирующей сывороткой, разведенной 1 :400. На основании полученных данных выдают второй предвари­тельный результат, где отмечают подвижность вибриона и его отношение к агглютинирующей сыворотке.

Одновременно производят пересев пленки в чашку со ще­лочным агаром. Если пленки нет или в ней мало вибрионов, делают пересев во вторую пептонную воду, которую также изучают спустя 5—6 часов.

После 10—16 часов просматривают посевы в чашках. Обычно через 9—10 часов на них появляется макроскопиче­ски различимый рост. Через 10 часов от начала исследова­ния изучают колонии в чашке с посевом нативного материа­ла, а через 16 часов — в чашках с посевом пленки из пептонной воды. Колонии холерного вибриона мелкие, проз­рачные с голубоватым оттенком. Однако определить подлин­ность холерного вибриона по культуральным признакам нельзя, так как холероподобные вибрионы образуют такие же колонии. Мелкие прозрачные колонии изучают микроско­пически: делают мазки, окрашивают фуксином Пфейффера, готовят препарат «висячей» капли, ставят ориентировоч­ную реакцию агглютинации на стекле с О-холерной сыво­роткой, разведенной 1 : 400, и выдают третий (последний) предварительный результат. Затем производят пересев по­дозрительных колоний на косой агар для выделения чистой культуры.

Рис. 90. Возбудитель трахомы (/), возбудитель орнитоза (2), возбу­дитель гонореи с включениями(З).

По истечении 18—24 часов от начала исследования прове­ряют чистоту культуры на косом агаре (достаточно интен­сивный рост появляется через 8 часов) и идентифициру­ют ее.

224

Холерный вибрион ферментирует сахарозу, маннозу, крахмал, не разлагает арабинозы, разжижает желатину, об­разует индол, восстанавливает нитраты в нитриты и не вы­зывает гемолиза эритроцитов.

Для выявления индола и нитритов в пептонную воду, со­держащую 0,01 % раствор азотнокислого калия, сеют вибри­он. Через 12—18 часов роста прибавление нескольких ка­пель серной кислоты вызывает покраснение среды, что ука­зывает на образование нитрозо-индола.

Для изучения гемолитических свойств выделенную куль­туру сеют на 1% пептонную воду, содержащую 2% отмытых бараньих эритроцитов. Холерный вибрион не дает гемолиза в жидкой среде (табл. 23). Некоторые штаммы холерного вибриона Эль-Тор обладают способностью к гемолизу.

Таблица 23 Дифференциация холерных и холероподобных вибрионов

	Ферментация в тече-
	ние 24 час		ов	Гемо-	Нитрозо-	Действие
				лиз
Виды вибриона				эритро-	иядоловая	холерного
	ман-	саха-	крах-	цитов	реакция	фага
	нозы	розы	мала
Холерные вибрионы	+	+	+		+	+
Холерные вибрионы Эль-
Тор	+	+	+	+	+	+
Холероподобные вибри-
оны	—	—	—	+	+	—

При исследовании проводят также пробу с фагом в жид* ких и на плотных питательных средах. В 2 пробирки с 4,5 мл мясо-пептонного бульона вносят по 0,5 мл холерного фага, разведенного в 10 и 100 раз, и по капле 4—5-часовой буль­онной культуры. В 3-ю пробирку с мясо-пептонным бульо­ном (контроль) вносят каплю культуры. Пробирки поме­щают в термостат, учет производят через 4—5 часов. На плотной среде делают посев бульонной культуры, чашку де­лят на 4 сектора. На 2 сектора наносят фаг, разведенный 1 : 10, на 3-й — в разведении 1 : 100, на 4-й не наносят фага. Холерный вибрион и вибрионы Эль-Тор лизируются специ­фическими фагами.

Одновременно ставят развернутую реакцию агглютинации с О-холерной сывороткой. Предварительный учет реакции производят через 2 часа. В случае отрицательного резуль-

225

тата, что может иметь место (свежевыделенные вибрионы иногда не агглютинируются специфической сывороткой), ставят феномен Исаева — Пфейффера (см. стр. 159).

Спустя 30—36 часов от начала исследования выдают окончательный результат, так как учет изменений «пестро­го» ряда и агглютинации производят через 12 часов. Опре­деляют вид выделенного вибриона на основании изучения морфологических, культуральных, ферментативных, анти­генных свойств и отношения к фагу. Агглютинация вибрио­на О-агглютинирующей сывороткой или положительный фе­номен Исаева — Пфейффера имеют решающее значение.

Трупный материал исследуют так же, как испражнения и рвотные массы больного.

Холерный вибрион может находиться в водоемах только в незначительной концентрации, поэтому для выявления его производят посевы больших объемов воды. Доставленную в лабораторию воду в объеме 900 мл подщелачивают насы­щенным раствором углекислой соды до рН 7,8—8, затем добавляют 100 мл основного пептона рН 8 (пептона 100 г, хлористого натрия 50 г, азотнокислого калия 1 г, углекисло­го натрия 20 г, дистиллированной воды 1000 мл) и разли­вают в колбы или флаконы по 100—200 мл. Посевы поме­щают в термостат при 37° на 5—8 часов. В дальнейшем исследование проводится так же, как других посевов в пеп­тонной воде (рвотные массы и испражнения). Более надеж­ные результаты дает метод фильтрации через мембранные фильтры. Исследуют большие количества воды 1,5—2,5 л. Осадок с фильтров сеют в пептонную воду (рН 8) и щелоч­ной агар.

Ускоренный метод диагноза холеры по Ермольевой.

Рвотные массы, испражнения сеют в 3 пробирки. В 1-й про­бирке содержится пептонная вода; во 2-й пробирке — пеп­тонная вода и О-холерная агглютинирующая сыворотка, разведенная до половины титра; в 3-й пробирке — пептон­ная вода с 0,1% растворимого крахмала. Посевы помещают в термостат при 37°. При наличии холерных вибрионов через 6 часов в 1-й пробирке образуется пленка, во 2-й пробирке появляются хлопья, оседающие на дно. В 3-й пробирке до­бавление раствора Люголя не вызывает посинения, так как холерные вибрионы обладают сильным диастатическим фер­ментом, расщепляющим в течение 5—6 часов крахмал с образованием декстринов. Из пленки в 1-й пробирке и осадка во 2-й пробирке делают мазки, обнаружение вибрио­нов дает право выдать положительный результат.

226

Этот метод можно использовать самостоятельно в том случае, если подтвержден обычным бактериологическим пу­тем хотя бы один случай заболевания холерой.

Быстрый метод массового исследования на носительство.

Во время вспышки холеры производят массовое исследова­ние на носительство холерного вибриона. Для проведения большего количества анализов в лаборатории одновременно исследуют испражнения от 10 человек. Фекалии берут стек­лянными трубками и помещают в одну колбу, содержащую 200 мл пептонной воды и О-холерную агглютинирующую сы­воротку, которая разведена до половины титра. Колбу ста­вят в термостат при 37°. Через 3—4 часа размножившиеся холерные вибрионы начинают агглютинироваться и хлопья­ми оседают на дно. Из осадка делают мазок и препарат «ви­сячей» капли. Если обнаружены грамотрицательные под­вижные вибрионы, оценивают результат как положитель­ный. В этом случае берут материал у каждого из 10 чело­век и исследуют его раздельно.

Быстрое обнаружение холерных вибрионов в питьевой воде. При

обильном заражении воды холерными вибрионами (не менее 100 вибрио­нов в 1 мл) используют реакцию агглютинации. К испытуемой воде до­бавляют слабо щелочной концентрированный раствор пептона в таком количестве, чтобы получился 1 % раствор. Этой смесью разводят О-хо­лерную агглютинирующую сыворотку от 1 : 100 до ее титра. Контролем является смесь без сыворотки. Пробирки помещают в термостат. Через 6 часов читают реакцию. Положительная реакция определяется появле­нием хлопьев в пробирке, где сыворотка разведена до половины титра или до титра.

На основании этих исследований выдают ориентировочный результат о наличии или отсутствии холерных вибрионов.

Применяют также методику быстрого обнаружения холерного виб­риона по нарастанию титра фага, которая изложена на стр. 214.