Лабораторная диагностика инфекций, вызываемых escherichia coli. Лабораторная диагностика брюшного тифа, паратифов а и в

Лабораторная диагностика болезней, вызываемых Е. coli

Е. coli является постоянным обитателем кишечника че­ловека. Однако некоторые серотипы ее могут вызывать ко-лиэнтериты, различные гнойно-воспалительные процессы, принимающие эпидемическое распространение в родильных домах, детских учреждениях и больницах. Этой инфекцией чаще поражаются дети грудного возраста. Тяжесть заболе­ваний бывает различная: от легких, стертых форм до тя­желых случаев с летальным исходом. Эти штаммы кишеч­ной палочки могут вызывать также пищевые токсикоин-фекции.

Для обнаружения патогенных серотипов кишечной па­лочки обычно исследуют испражнения, рвотные массы, при гнойно-воспалительных процессах — гной, отделяемое сли­зистой оболочки зева и носа, от трупов — содержимое ки­шечника, кровь, материал из селезенки, легких и других внутренних органов. Подлежат исследованию также про­мывные воды, смывы рук обслуживающего персонала, воз­дух палат, медикаменты, применяемые per os, остатки пищи (при токсикоинфекции). Посевы на среду Эндо и Плоскирева (последнюю используют для выделения дизентерийных бак­терий и салмонелл) лучше производить у постели больного. У маленьких детей трудно собирать испражнения, поэтому

206

их берут катетером, который вводят в прямую кишку. Сле-i,i фекалий на катетере снимают стерильным ватным тампо-6м и сеют вначале на среду Плоскирева, а потом на среду ндо. Посевы помещают в термостат при 37°. Через 18— 4 часа инкубации изучают колонии кишечной палочки на среде Эндо.

В настоящее время описано свыше 140 различных серо­типов Е. coli, которые содержат специфические О-антигены. Патогенными для человека являются серологические типы 025, 026, 044, 055, 075, 086, 0111, 0112, 0114, 0119, 0125, 0127, 0128, 145, 408, вызывающие колиэнтериты. Гнойно-воспалительные процессы и пищевые токсикоинфекции мо­гут быть обусловлены самыми различными типами. Кроме соматических О-антигенов, выявлены оболочечные антигены. Среди последних имеется В-антиген, характеризующийся термолабильностью и строгой специфичностью, например, ' coli типа 026 имеет антиген В₆, типа 055 — В₅, типа 0111 — В₄ ит. д.

Для предварительного исследования смешивают 3—4 аг­глютинирующие сыворотки патогенных серотипов и добав­ляют изотонический раствор хлористого натрия в таком ко­личестве, чтобы каждая из них была разведена 1 : 10. От­мечают 10 колоний Е. coli и агглютинируют на стекле этой смесью. В случае резко выраженной реакции агглютинации выделяют чистую культуру, пересевают колонии на скошен­ный агар. На следующий день выделенные бактерии агглю­тинируют на стекле раздельно каждой сывороткой, также разведенной 1 : 10. При положительной реакции агглюти­нации с какой-либо сывороткой ставят развернутую реак­цию агглютинации. Посредством этой реакции выявляют О- и Н-антигены бактерий. Диагностическую сыворотку раз­водят в двух рядах пробирок, на этикетке ампулы с сыво­роткой отмечены титры для О- и В-агглютининов. Для вы­явления В-антигена в один ряд пробирок вносят смытую с косого агара негретую культуру, для выявления О-антиге-на используют кипяченую в течение 1—2¹/₂ часов взвесь бактерий. Кипячение вызывает разрушение В-антигена, ко­торый расположен поверхностнее О-антигена и угнетает последний. Пробирки помещают на сутки в термостат при 37°. Гомологичные сыворотке штаммы агглютинируются до титра или до половины титра.

При отрицательной реакции агглютинации в предвари­тельном исследовании (агглютинация бактерий из коло­ний) выдается отрицательный результат.

207

Серологический метод исследования — изучение сыворо­ток больных, как правило, не используется, так как агглю­тинины вырабатываются у больных медленно и в неболь­шом количестве.

Лабораторная диагностика брюшного тифа, паратифов А и В

Возбудителем брюшного тифа является Salmonella typho-sa (см. рис. 79, е). Salmonella paratyphi, Salmonella schot-tmuelleri вызывают клинически сходное заболевание, кото­рое может быть дифференцировано только с помощью ла­бораторных методов.

От больного для исследования берут кровь, испражнения, мочу; от носителей — испражнения, содержимое двенадца­типерстной кишки, мочу; от трупа —кровь, содержимое ки­шечника, желчь и паренхиматозные органы. Кроме того, исследуют воду, пищевые продукты.

Лабораторные исследования проводят с учетом стадии заболевания. В первые дни сеют кровь для выделения ге­мокультуры. В начале 2-й недели берут кровь для реакции Видаля. В конце 2-й и в течение 3-й недели производят исследование испражнений и мочи больного. У реконвалес-центов сеют испражнения для выявления носительства.

Выделениегемокультуры относится к ранним ме­тодам бактериологической диагностики брюшного тифа.

В первые дни заболевания, соблюдая правила асептики, из локтевой вены берут 5—10 мл крови и сеют в одну из сред накопления: в 100 мл 10% желчного бульона или сре­ду Рапопорт. Основой среды Рапопорт служит 10% желч­ный бульон, к которому добавляют 1% маннита или 2% глюкозы, 1% индикатора Андреда, во флакон со средой помещают поплавок для улавливания газа. В качестве сре­ды накопления можно использовать бычью желчь в объе­ме 10 мл.

Возбудители брюшного тифа и паратифов А и В находятся в крови в течение всего лихорадочного периода, но коли­чество их постепенно уменьшается. В связи с этим во 2-ю неделю заболевания следует производить посев 15—20 мл крови.

Посевы помещают в термостат на 18—24 часа. В среде Рапопорт изменения наступают на 2-й день. При размноже­нии брюшнотифозных салмонелл отмечается покраснение среды, так как происходит расщепление маннита или глю-

208

козы с образованием кислоты. Если в крови находились парати­фозные салмонеллы, то одновре­менно с покраснением среды на­блюдается образование газа_; В желчном бульоне и бычьей желчи изменений при размноже­нии бактерий установить не удается.

Из сред накопления делают пе­ресев на скошенный агар и в чашку со средой Эндо (2-й день исследования). Посев в чашку со средой Эндо позволяет выделить чистую культуру при загрязнении | воздушной флорой среды накоп­ления (неправильное охлаждение шприца, плохая дезинфекция ко­жи перед взятием крови).

Через 18—24 часа инкубации в термостате изучают посев на скошенном агаре и на среде Эн­до. Если на скошенном агаре вы­росла чистая культура — нежный полупрозрачный налет, присту­пают к ее идентификации. Посев в чашках исследуют в случае за­грязненного роста на скошенном агаре.

Выделенную культуру (3-й день исследования) сеют в среды «пе­строго» ряда и ставят ориентиро­вочную реакцию агглютинации с тремя агглютинирующими сыво­ротками: брюшнотифозной, па­ратифозными А и В, разведенны­ми 1 : 25.

В случае положительной реак­ции с одной из сывороток ставят развернутую реакцию агглютина­ции, сыворотку в этом случае раз­водят до титра. Гемокультура может иметь Vi-антиген. При от­сутствии агглютинации О-сьшо-

ротками следует ввести Vi-сыворотки или разрушить Vi-ан-тиген. Для этой цели прогревают культуру при 60° в течение 30 минут или в течение 5 минут при 100°.

На следующий день (4-й день от начала исследования) производят учет изменений сред «пестрого» ряда (табл. 18), окончательный учет реакции агглютинации и выдают ре­зультат исследования.

Посев крови в среде накопления оставляют в термостате до выдачи результата, так как в некоторых случаях раз­множение возбудителей в желчных средах происходит мед­ленно. Следует производить пересевы на скошенный агар и среду Эндо через каждые 24—48 часов в течение 7— 10 дней.

Для ускорения исследования выделенную культуру мож­но агглютинировать монорецепторными сыворотками. По­ложительная реакция агглютинации дает право прекратить дальнейшее исследование и выдать результат.

Обнаружение брюшнотифозных или паратифозных сал­монелл в крови является несомненным доказательством за­болевания. В настоящее время выделение гемокультуры приобретает особенное значение, так как заболевание брюш­ным тифом чаще протекает атипично.

Реакция Видал я. Обнаружение антител к возбуди­телям брюшного тифа, паратифа А и паратифа В в сыво­ротке больных производят с 8—10-го дня заболевания. Для постановки реакции Видаля (табл. 19) берут 2—3 мл крови из локтевой вены или 1 мл из пальца, мочки уха. Пробирку с кровью помещают в термостат на 20—30 минут, после об­разования сгустка переносят в холодильник или в стакан с холодной водой, чтобы скорее отделилась сыворотка.

210

явления Vi-антнтел является непрямая Vi-гемагглютина-ция. Применение стандартного эритроцитарного Vi-диагно-стикума облегчает использование этой реакции.

Исследование испражнений обычно производят со 2—3-й недели заболевания, так как к этому времени брюшнотифозные и паратифозные салмонеллы поступают с желчью в кишечник. Испражнения для исследования бе­рут в стерильные пробирки или баночки в количестве 5— 10 г (см. стр. 123). При взятии материала следует исклю­чить действие дезинфицирующих веществ. Посев лучше про­изводить в больнице, обучив этой методике обслуживаю­щий персонал. Фекалии сеют ватным тампоном в одну чаш­ку со средой Плоскирева.

На 2-й день после 18—24-часовой инкубации в термо­стате отмечают бесцветные колонии, изучают их морфоло­гию и структуру и пересевают на скошенный агар.

На 3-й день исследования чистую культуру выделенных бактерий сеют в среды «пестрого» ряда и ставят ориенти­ровочную, а потом развернутую реакцию агглютинации. Та­ким образом, идентификация чистой культуры, выделенной из фекалий (копрокультура), ничем не отличается от иден­тификации гемокультуры.

На 4-й день от начала исследования учитывают изменения сред «пестрого» ряда, реакцию агглютинации и выдают ответ.

Положительный результат— выделение возбудителей брюшного тифа и паратифов из испражнений не всегда да­ет возможность поставить диагноз этих заболеваний, так как у здоровых людей наблюдается носительство брюшно­тифозных и паратифозных салмонелл.

От реконвалесцентов испражнения исследуют перед вы­пиской из больницы. Результат должен быть дважды отри­цательным.

Исследованию на возможное носительство подвергаются переболевшие брюшным тифом и паратифами, а также ра­ботники пищевых объектов, водопроводных систем, детских учреждений. Этим лицам натощак дают выпить 100 мл 30% раствора сернокислого магния или натрия. Последние яв­ляются желчегонными и оказывают послабляющее действие. Не ранее чем через 2—4 часа после приема слабительного собирают испражнения.

Посев производят на среду Плоскирева и одновременно в среду накопления (желчный бульон), из которой после 6 часов выдерживания в термостате делают пересев на сре-

212

Полученную сыворотку последовательно разводят в трёК араллельных рядах пробирок от 1 : 100 до 1 : 800 и вносят -диагностикумы: в пробирки первого ряда —брюшноти­фозный, второго — паратифозный А и третьего — парати­фозный В (табл. 20). Применение О-диагностикумов дает возможность выявить О-антитела, которые появляются со 2-й недели и исчезают к концу заболевания.

Таблица 20

Учет реакции с тремя диагностикумами

Разведение " сыворотки Диагностикум —«^^	1 : юо	1 : 200	1 : 400	1 : 800	Контроль сыворотки	Контроль диагнос-тикума
Брюшнотифозный Паратифозный А Паратифозный В

Выявление Н-антител не представляет диагностической ценности, так как они обнаруживаются у больных в конце заболевания, а также у переболевших и вакцинированных.

Однако в некоторых случаях О-антитела можно выявить у привитых и поэтому необходимо изучать реакцию Видаля в динамике, наблюдая за нарастанием ее титра. Напри­мер, при первой постановке реакции Видаля получены по­ложительные результаты с каким-либо диагностикумом в разведении 1 : 100, повышение титра при повторной реак­ции с кровью больного, взятой через 3—4 дня, подтверж­дает диагноз.

Если сыворотка крови больного агглютинирует одновре­менно два или три вида диагностикумов, следует учесть титр агглютинации. Обычно специфическая агглютинация происходит с большими, а групповая с меньшими разве­дениями сыворотки.

В настоящее время возникают большие затруднения в оценке реакции агглютинации, в связи с тем что с первых дней заболевания лечение больных брюшным тифом и па-ратифами проводят антибиотиками. Антибиотики изменя­ют антигенные свойства бактерий, вследствие чего замед­ляется или прекращается выработка антител. В таких слу­чаях реакция Видаля не может подтвердить заболевание.

Реакцию Видаля с Vi-диагностикумами используют для выявления носительства брюшнотифозных салмонелл у здоровых людей. Более чувствительной реакцией для вы­-

211

­

ду Плоскирева. Дальнейшее исследование проводится так же, как материала от больного.

Мочу исследуют у больных на 3-й неделе заболевания и у здоровых людей на носительство. Ее собирают в стерильные пробирки в количестве 10—15 мл. Сначала про­изводят посев нескольких капель нативной мочи в чашки Петри с агаром Плоскирева, затем сеют осадок мочи в чаш­ку с той же средой и в среду накопления — желчный буль* он. Кроме того, делают посев дуоденального содержимо­го, соскоба розеол, секционного материала. В этих случаях выделение чистой культуры и ее идентификация не отли­чаются от описанного выше выделения гемо- и копрокуль-тур.

Брюшнотифозные и паратифозные А и В салмонеллы имеют внутри каждого вида типы, которые лизируются со­ответствующими Vi- и О-типами фага. Определение типов салмонелл, выделенных от больных и носителей, дает воз­можность установить источник заболевания. Характерно по­стоянство типов для определенных местностей, стран.

Методика определения фаготипов салмонелл подобна оп­ределению типов стафилококков.

Исследование воды. Патогенные микробы выделя­ются с фекальными массами в незначительном количестве. Кроме того, попадая в воду, нечистоты разводятся таким образом, что при исследовании обычных объемов (500 мл) возбудителей заболеваний не удается обнаружить. Поэтому применяются способы, позволяющие концентрировать мик­робы воды. Лучшим из подобных методов является иссле­дование при помощи мембранных фильтров.

Воду в объеме 2 л и более пропускают через фильтр 3. Если вода содержит большое количество взвешенных ча­стиц, затрудняющих фильтрацию, ее предварительно про­пускают через нитроцеллюлозную пленку 5, которая задер­живает грубые частицы. Фильтр 3 с осадком погружают в желчный бульон или накладывают его на висмут-сульфит­ный агар. Из желчного бульона через 6—10 часов инкуба­ции в термостате делают пересев на среду Плоскирева. Дальнейшее исследование проводится так же, как исследо­вание испражнений. С висмут-сульфитного агара после выдерживания в термостате в течение 2 суток отбирают чер­ные колонии и идентифицируют обычным путем.

Исследование воды на присутствие брюшнотифозного и паратифозного фага обычно применяется в тех случаях, ког­да нельзя выявить бактерии.

213

В сточных водах можно обнаружить фаг при непосредст­венном исследовании их. Для этой цели воду пропускают через бактериальный фильтр. В стерильную чашку Петри вносят 1—2 мл испытуемого фильтрата, наливают 15— 20 мл остуженного до 45° мясо-пептонного агара, тщатель­но смешивают. После застывания агара сеют секторами культуры брюшнотифозной, паратифозных А и В салмо­нелл.

Наличие негативных колоний подтверждает присут­ствие соответствующего фага. При исследовании питьевой воды производят обогащение, т. е. сеют воду в концентриро­ванный раствор пептона. К 100 мл испытуемой воды до­бавляют 10 мл пептона (100 г пептона, 50 г NaCl на 1 л во­ды). Посевы выдерживают в термостате сутки, после чего фильтруют и исследуют фильтрат на наличие фага.

Обнаружение брюшнотифозных салмо­нелл при помощи увеличения титра фага. В настоящее время разработана методика, позволяющая обнаружить незначительные количества микробов в воде и других объектах. Сущность этого метода заключается в том, что к воде добавляют определенный объем брюшнотифоз­ного так называемого индикаторного фага, содержащего в 1 мл известное количество корпускул. Если в исследуемой воде находятся брюшнотифозные салмонеллы, то количе­ство корпускул фага увеличивается, в противном случае титр фага будет равен исходному. Таким способом можно выявить от 10 до 20 клеток брюшнотифозных салмонелл в 1 л воды.