Лабораторная диагностика бруцеллеза

Возбудители бруцеллеза относятся к роду Brucella, кото­рый включает три вида: Brucella melitensis, Brucella bovis, Brucella suis.

С целью диагностики бруцеллеза используют: серологичес­кий, аллергический, бактериологический и биологический методы. Серологический и аллергический методы диагности­ки бруцеллеза производят в обычных микробиологических лабораториях. Чистую культуру бруцелл выделяют в спе­циальных лабораториях. Для этой цели от больных берут кровь, пунктат костного мозга грудины, мочу и др., из пи­щевых продуктов — молоко и молочные продукты.

К серологическим исследованиям относят реакцию агглютинации с сывороткой больного (реакция Райта), ускоренную пластинчатую реакцию на стекле (ре­акция Хеддльсона), опсонофагоцитарную пробу и реакцию связывания комплемента.

Реакцию Райта ставят в начале 2-й недели, т. е. в период достаточного накопления антител. В качестве диагности-кума используют взвесь, окрашенную генцианом фиолето­вым или метиловым и содержащую в 1 мл 1 млрд. бруцелл, убитых формалином или фенолом.

Техника постановки этой реакции аналогична реакции агглютинации для диагностики туляремии, за исключением того, что сыворотку и антиген разводят 0,85% раствором

201

NaCl, содержащим 0,5% раствор фенола. Пробирки поме­щают в термостат на 18—20 часов, а затем оставляют на 2 часа при комнатной температуре. Результат агглютина­ции обозначается плюсами. Реакция оценивается положи­тельной при титре 1 :200 (не менее + + ) и сомнительной — при титре 1 :50. Реакция Райта может быть положитель­ной у привитых и больных туляремией. Поэтому ее ставят повторно, учитывая нарастание титра.

Таблица 16

Схема постановки пластинчатой реакции агглютинации Хеддльсона

^^^^ Квадрат					Контроль
	1-Й	2-й	3-й	4-й	сыворотки	антигена
Ингредиенты (в мл)^-\					5-й	6-й
0,85% раствор NaCl Сыворотка больного Диагностикум	0,08 0,03	0,04 0,03	0,02 0,03	0,01 0,03	0,03 0,02	0,03 0,03

Пластинчатая реакция агглютинации Хеддльсона (табл. 16) чаще используется в очагах бруцеллеза (в поле­вых условиях), так как техника постановки ее несложная. Стеклянную пластинку делят восковым карандашом на 6 квадратов и наносят микропипеткой неразведенную испы­туемую сыворотку в количестве 0,08—0,04—0,02—0,01— 0,02 мл, добавляют тот же диагностикум, что и для реак­ции Райта по 0,03 мл к каждой дозе сыворотки, кроме последней (5-й квадрат), в которую вносят 0,03 мл изото­нического раствора (контроль сыворотки). В 6-м квадрате находятся 0,03 мл антигена и 0,03 мл изотонического раст­вора (контроль диагностикум а). Капли сыворотки и ан­тигена смешивают стеклянной палочкой и после легкого покачивания стекла приступают к учету реакции, которая появляется уже в первые минуты в виде тонкозернистого окрашенного агглютината. Отсутствие агглютинации во всех дозах сыворотки оценивается как отрицательная реак­ция, наличие агглютинации в первой дозе (0,08 мл сыво­ротки) — как сомнительная, во второй дозе (0,04 мл) —как слабо положительная, в третьей или четвертой дозах (0,02— 0,01 мл)—как положительная, реакция агглютинации, вы­раженная четырьмя плюсами во всех дозах, оценивается как резко положительная. Недостатком ее является высо­кая чувствительность, нередко регистрируются положитель-

202

концентрацию углекислоты можно й таким способом: го­рящую ватную пробку глубоко вводят в горлышко флако­на с посевом, флакон дополнительно закрывают резиновой пробкой и заливают парафином. Посевы помещают в тер­мостат при 37° и, учитывая медленный рост бруцелл, вы­держивают их до одного месяца. Через каждые 4—5 дней делают пересевы на печеночный скошенный агар и агар «D». Сухой питательный агар «D» повышает степень высевае-мости бруцелл. Он состоит из питательного бульона, дрож­жевого автолизата и хлористого натрия (рН 7,2—7,4).

При формировании роста мелких изолированных колоний на плотной среде устанавливают чистоту культуры и опре­деляют вид бруцелл (см. ниже).

Пунктат костного мозга (выделение миелокультуры),, взятый шприцем из грудины, сеют на те же среды. Установ­лено, что миелокультуры при бруцеллезе получают в 17₂ — 2 раза чаще, чем гемокультуры.

Мочу (выделение уринокультуры) асептически берут ка­тетером в конце лихорадочного периода и центрифугируют.. Из осадка делают посевы в чашки с печеночным агаром,, содержащим генциан фиолетовый в разведении 1 :200 ООО для задержки роста грамположительной микрофлоры. Ури­нокультуры получают в 9—14% случаев.

М олоко животных (коз, овец, коров) центрифугируют и 0,1—0,2 мл сливок засевают в чашки с печеночным агаром, содержащим генциан фиолетовый.

Заражение куриных яиц. Наибольшую высевае-мость бруцелл получают при посевах исследуемого материа­ла в желток свежего куриного яйца или желточный мешок куриного эмбриона. Кровь разводят 1 : 3 цитратным бульо­ном и в количестве 0,1—0,2 мл вводят в несколько яиц. За­раженные яйца выдерживают в термостате 5 дней при темпе­ратуре 37° и затем 0,3—0,5 мл содержимого яиц переносят в соответствующие плотные и жидкие питательные среды, посевы исследуют каждые 2—3 дня. При заражении яиц материалом, содержащим посторон­нюю микрофлору (испражнения, моча, мокрота, гной и др.), его предварительно центрифугируют. Полученный осадок разводят раствором генциана фиолетового (1 : 200000) вЗ— 5 раз и вносят в 3—5 яиц по 0,2 мл с последующим пересе­вом через 5 дней на питательные среды.

Биологический метод широко используется в спе­циальных лабораториях. Наиболее восприимчивыми живот­ными при любом методе заражения являются морские

ные результаты с сыворотками здоровых людей за счет наличия нормальных антител. Поэтому с сыворотками, дав­шими положительную пластинчатую реакцию Хеддльсона, обязательно ставят реакцию Райта.

Опсоно-фагоцитарную пробу ставят с 15—20-го дня бо­лезни с 4-миллиардной взвесью убитых бруцелл (см. стр. 168).

Считают, что показатель в пределах 10—24 характеризует слабо положительную реакцию, в пределах 25—49 — ясно выраженную и в пределах 50—75 — резкую. У здоровых людей цифровой показатель этой реакции, как правило, бывает равен 0 или 1, редко 3—5.

Реакция связывания комплемента при бруцеллезе весьма специфична. Она может быть положительной, начиная с 20—25-го дня заболевания, и длительно со­храняться.

Внутрикожную аллергическую пробу Бюрне используют для выявления аллергического состояния у больных и пере­болевших бруцеллезом. Ее ставят с 15—20-го дня заболе­вания. Внутрикожно в область средней трети предплечья вводится 0,1 мл бруцеллина. При положительном результа­те через сутки на месте введения появляется болезненность, краснота (рис. 81) и отечность размером в среднем 3X3 см (слабо положительная реакция—1X1 см, резко положи­тельная— 6X6 см). Аллергическая реакция сохраняется в течение многих лет после перенесенного заболевания бру­целлезом и бывает положительной у привитых.

Бактериологический метод. Для выделения чи­стой культуры бруцелл исследуют кровь, пунктат костного мозга, мочу, молоко.

Посев крови (выделение гемокультуры) производят в первые дни лихорадочного состояния, при отрицательных результатах исследование повторяют, так как бактериемия наблюдается в течение одного года и реже до 2 лет.

Из локтевой вены берут стерильно не менее 10 мл крови и засевают по 5 мл в 2 флакона со 100 мл печеночного или асцитического бульона рН 7,1—7,2 или мясо-пептонного бульона с добавлением 1% раствора глюкозы, 2% раство­ра глицерина и антифаговой сыворотки с целью подавления фага. Для предупреждения свертывания крови к средам прибавляют 0,2% раствора лимоннокислого натрия. Один флакон для выделения Brucella bovis помещают в гермети­чески закрывающийся сосуд с 10% углекислоты, поступаю­щей через газометр из баллона. Получить необходимую

203

свинки и белые мыши. Кровь больных в количестве 2—3 мл вводят морским свинкам и в количестве 0,5—1 мл — белым мышам внутрибрюшинно. Осадок мочи, сливки, отцентри-фугированные из молока животных, вводят подкожно.

Через 20—30 дней после заражения у свинки берут кровь и ставят реакцию агглютинации. Затем животных убивают, вскрывают и производят посевы крови из сердца, взвеси из внутренних органов и лимфатических узлов.

Дифференциация видов бруцелл. При наличии роста бру­целл, независимо от их. вида, в бульоне появляется помут­нение с последующим образованием слизистого осадка. В чашках с печеночным агаром бруцеллы образуют мелкие гладкие беловато-мутные колонии с перламутровым оттен­ком. Они не ферментируют углеводов, не свертывают моло­ко и не разжижают желатину. Различные виды бруцелл со­держат одинаковые антигены. Поэтому идентифицировать их серологическими методами не удается. Бруцеллы диф­ференцируют по отношению их к углекислоте, выделению сероводорода и чувствительности к бактериостатическому действию анилиновых красителей. Наиболее устойчивой к действию анилиновых красителей является Brucella meli-tensis. Применяемые красители, за исключением тионина, оказывают бактериостатическое действие на Brucella suis (табл.17).

Таблица 17

204

205

Задания

1. Микроскопия мазков с окрашенными туляремийными, чумными бактериями и бруцеллами.

2. Постановка и предварительный учет развернутой реак­ции агглютинации для диагностики туляремии.

3. Постановка и учет пластинчатой реакции агглютина­ции Хеддльсона.

4. Постановка аллергической пробы для диагностики ту­ляремии и бруцеллеза.

5. Изучение препаратов, применяемых для диагно­стики, лечения и профилактики чумы, туляремии, бруцел­леза.